【摘要】： 隨著抗生素長(zhǎng)期大量應(yīng)用(包括濫用)，細(xì)菌耐藥菌株隨之大量出現(xiàn)，已成為感染性疾病治療缺乏療效的難題之一。細(xì)菌的耐藥性引起了醫(yī)學(xué)界及社會(huì)的極大關(guān)注，成為全球普遍關(guān)心的公共衛(wèi)生問題，而搞清細(xì)菌耐藥機(jī)制被認(rèn)為是克服細(xì)菌耐藥性的關(guān)鍵之一。 銅綠假單胞菌因其內(nèi)在特點(diǎn)，對(duì)多種抗菌藥物表現(xiàn)出天然或獲得性耐藥。因此，銅綠假單胞菌耐藥株可作為研究細(xì)菌耐藥的分子機(jī)制，研究開發(fā)抗耐藥細(xì)菌藥物的模型菌株。本研究首先從128株銅綠假單胞菌臨床分離株中，獲得大量對(duì)喹諾酮類藥物耐藥菌株；接著對(duì)耐藥株Ⅱ類拓?fù)洚悩?gòu)酶基因突變與耐喹諾酮類藥物的關(guān)系，MexAB-OprM主動(dòng)外排系統(tǒng)oprM結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，mexR調(diào)節(jié)基因在MexAB-OprM外排系統(tǒng)中的作用以及gyrA基因突變與MexAB-OprM主動(dòng)外排在細(xì)菌生物膜耐藥機(jī)制中的作用等進(jìn)行了較為深入的研究。通過對(duì)銅綠假單胞菌耐藥的分子機(jī)制一步步的深入研究，無(wú)疑將加深人們對(duì)細(xì)菌耐藥性理解。這對(duì)于合理使用抗菌藥物，尋找抗菌藥物作用的新靶點(diǎn)，指導(dǎo)研究開發(fā)新的抗菌藥物，解決細(xì)菌耐藥性問題等都具有重要意義。 128株銅綠假單胞菌臨床分離株對(duì)常用抗菌藥物的耐藥性研究表 四川人學(xué)博卜學(xué)位論文 針J綠假單胞耐哇諾酮類藥物的分了機(jī)制研究 明:銅綠假單胞菌對(duì)頭飽曲松、諾氟沙星和環(huán)丙沙星的耐藥率高達(dá) 69.5%、57.8%和26.6%。其中，有17株對(duì)四種喳諾酮類藥物呈交叉耐 藥，占臨床分離株的13.3%;13株對(duì)實(shí)驗(yàn)所用的抗菌藥物表現(xiàn)出多重 耐藥性，占臨床分離株的10.2%�？梢娿~綠假單胞菌臨床分離株耐藥 的嚴(yán)重性。 用微量棋盤稀釋法對(duì)哇諾酮與p一內(nèi)酸胺類藥物聯(lián)合用藥研究顯 示，左氧氟沙星、環(huán)丙沙星與頭飽他咤、呱拉西林聯(lián)合用藥對(duì)大多數(shù) 臨床分離銅綠假單胞菌具有協(xié)同或相加作用，其抗菌活性明顯增強(qiáng)。 因此，抗假單胞菌的p一內(nèi)酞胺類藥物與喳諾酮類藥物聯(lián)合用藥治療銅 綠假單胞菌感染是切實(shí)可行的。 對(duì)20株銅綠假單胞菌環(huán)丙沙星耐藥株(從128株銅綠假單胞菌臨 床分離的環(huán)丙沙星耐藥株中按每一MIC濃度梯度隨機(jī)挑選3株)H類 拓?fù)洚悩?gòu)酶舒rA、歲rB、parC和parE基因的哇諾酮藥物耐藥決定區(qū) 基因突變與耐藥性關(guān)系研究結(jié)果顯示，90%的耐藥株H類拓?fù)洚悩?gòu)酶基 因發(fā)生了突變(20株中有18株)。突變主要發(fā)生在舒rA基因(18株) 和parC基因(10株)上，其中，了A基因的第83位氨基酸密碼子表 現(xiàn)出高頻突變(17株，ACC一ATC，占耐藥突變株的94.4%)，只有2 株耐藥株的多?B和parE基因分別發(fā)生單點(diǎn)突變。而發(fā)生2個(gè)以上基 因突變的變異株大都是高水平耐藥株。在這些n類拓?fù)洚悩?gòu)酶基因突 變耐藥株中，有4株對(duì)所有試驗(yàn)的喳諾酮和p一內(nèi)酞胺類藥物都表現(xiàn)出 高水平的耐藥。表明這些耐藥株，除11類拓?fù)洚悩?gòu)酶基因突變引起耐 藥外，還可能存在其它形式的耐藥機(jī)制。 對(duì)20株銅綠假單胞菌哇諾酮類藥物耐藥株的舒rA基因PCR產(chǎn)物進(jìn) 行RFLP分析表明，用PcR擴(kuò)增銅綠假單胞菌酬A基因的哇諾酮耐藥 決定區(qū)，然后用SacH酶切擴(kuò)增片段，可快速檢測(cè)名廠A基因第83位氨 四川人學(xué)博!:學(xué)位論文 銅綠假單胞耐喳諾酮類藥物的分子機(jī)制研究 基酸密碼子發(fā)生點(diǎn)突變的銅綠假單胞菌哇諾酮藥物耐藥株。 用熒光法測(cè)定對(duì)環(huán)丙沙星不同敏感性的銅綠假單胞菌細(xì)胞內(nèi)環(huán)丙 沙星蓄積量研究表明，多重耐藥株細(xì)胞內(nèi)環(huán)丙沙星穩(wěn)定態(tài)濃度顯著低 于敏感株;加入能量抑制劑碳酞氰基一對(duì)一氯苯蹤，所有菌株細(xì)胞內(nèi)環(huán)丙 沙星蓄積量增加，但只有多重耐藥株細(xì)胞內(nèi)環(huán)丙沙星的濃度增加顯著， 表明多重耐藥株具有主動(dòng)外排作用。 MexAB一OPrM主動(dòng)外排是導(dǎo)致野生型銅綠假單胞菌對(duì)多種抗生素 產(chǎn)生耐藥性的主要因素。用PCR和DNA測(cè)序方法，對(duì)MexAB一OPrM 外排系統(tǒng)結(jié)構(gòu)基因oprM研究表明，所有菌株的oprM基因未發(fā)生突變 或缺失。用RT一PCR方法研究oprM基因表達(dá)結(jié)果顯示，只有多重耐藥 株的oprM基因能在RNA水平上高表達(dá)，oprM基因的高表達(dá)導(dǎo)致 MexAB一OprM的主動(dòng)外排。 對(duì)MexAB一OPrM外排系統(tǒng)的調(diào)節(jié)基因mexR的研究結(jié)果顯示，銅 綠假單胞菌主動(dòng)外排多重耐藥株P(guān)NI和PN16的mexR基因編碼第“ 位氨基酸的堿基發(fā)生了單點(diǎn)突變;將含有mexR突變基因的重組質(zhì)粒 pMD 18一丁/mexR轉(zhuǎn)化到了銅綠假單胞菌敏感菌隊(duì)2中，重組菌PAZ獲得 了對(duì)環(huán)丙沙星的部分耐藥性。用RT一PCR方法在重組菌隊(duì)2中擴(kuò)增出 了oprM基因片段。這說明MexAB一OPrM主動(dòng)外排系統(tǒng)，可能受mexR 基因的調(diào)控。因此，我們有理由相信，mexR基因?qū)⒂锌赡艹蔀楹Y選抑 制主動(dòng)外排耐藥系統(tǒng)藥物的分子靶點(diǎn)。 生物膜細(xì)菌具有極強(qiáng)的耐藥性和抵抗機(jī)體免疫系統(tǒng)作用的能力。 用綠色熒光蛋白基因(加)標(biāo)記銅綠假單胞菌敏感株，選用特氟隆作為生 物膜形成的附著物，對(duì)銅綠假單胞菌舒rA基因突變和MexAB一OPrM主 動(dòng)外排在細(xì)菌生物膜耐藥中的作用進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，，在生物膜形 成的過程中，生物膜細(xì)菌在MBC濃度的環(huán)丙沙星溶液中4小時(shí)的存活 四川大學(xué)博卜學(xué)位論文 銅綠假單胞耐哇諾酮類藥物的分子機(jī)制研究 率，呈現(xiàn)出一個(gè)與細(xì)菌生長(zhǎng)曲線相似的規(guī)律;無(wú)論是敏感株，還是 MexA
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250bP100bP圖2一2:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物靈敏度的瓊脂糖凝膠電泳圖譜FigZ一2:sensitivitiesofPCRamPlifieationofQRDRof歲rAgeneM:DNAmarker(DL2000);l~6:TheresultofPCRamPlifieationwithDNAconcentrationdeereaseprogressively(from3林g/mlto3.7sxlo‘林g/ml)33

1學(xué)位論文銅綠假單胞菌耐哇諾酮類藥物的分子機(jī)制研究圖2一1:銅綠假單胞菌DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖譜FigZ一1EleetroPhoresisofgenomieDNAof尸aerugi，10Sal一7:GenomieDNAofthedifferentstrainofPaeruginosa200ObPn尸卜Uo.n尸nUkU‘UnU幾UnU

本文編號(hào)：2599221