【摘要】：機體的蛋白質(zhì)大多以糖蛋白或稱糖復合物的形式存在。蛋白質(zhì)上的聚糖不僅對蛋白質(zhì)的折疊、成熟、裝配、穩(wěn)定性和降解、以及蛋白質(zhì)的生物學活性等方面有著重要的調(diào)節(jié)作用，而且其本身作為一種信息分子，在細胞-細胞、細胞-基質(zhì)、細胞-分子和分子-分子間的相互作用，以及細胞的活化、增殖、分化和死亡等方面都有著重要的作用。但蛋白質(zhì)糖基化和聚糖結(jié)構(gòu)的多樣性和復雜性使這方面的研究面臨重重困難。蛋白質(zhì)的糖基化是在多種糖�；D(zhuǎn)移酶和糖苷酶的催化下進行的。編碼這些酶的基因的不斷發(fā)現(xiàn)和克隆對蛋白質(zhì)糖基化和聚糖的生物學意義的研究起到了積極的推動作用，并得到了一些預想不到的結(jié)果。但迄今為止，有關(guān)這方面的研究進展還很小。因此，亟待作出更多的努力，以揭示蛋白質(zhì)糖基化和聚糖的生物學意義，以及其作用產(chǎn)生和調(diào)節(jié)的規(guī)律。研究蛋白質(zhì)糖基化可采用多種方法，反義核苷酸技術(shù)即為其中之一。 我們從一個人扁桃體cDNA文庫中分離到了一個長為1358 bp的cDNA(6A8)，此cDNA與編碼大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)α-甘露糖苷酶的基因有很高的同源性。α-甘露糖苷酶是一類蛋白質(zhì)糖基化加工過程中重要的糖苷酶，負責聚糖中甘露糖的修剪。因此，6A8 cDNA的分離使我們能夠介入蛋白質(zhì)糖基化與細胞功能的研究。本實驗室的研究已發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染6A8 cDNA的反義DNA的人鼻咽癌細胞CNE-2L2肺轉(zhuǎn)移率下降，運動性和侵襲性也受到抑制。本博士學位論文首先探討了6A8 cDNA的性質(zhì)，初步證明了其編碼一種α-甘露糖苷酶。然后構(gòu)建了腺相關(guān)病毒(AAV)載體pAGX(+)，并采用該載體介導6A8基因的正義和反義DNA轉(zhuǎn)導入人淋巴細胞，研究干擾蛋白質(zhì)糖基化對淋巴細胞功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)導反義6A8 DNA引起人B細胞BJAB發(fā)生oncosis，而使人B細胞SKW6和T細胞Jurkat對凋亡誘導產(chǎn)生耐受。 首先，依據(jù)Con A的配體是甘露糖，而α-甘露糖苷酶的作用是修剪細胞糖蛋白聚糖中甘露糖的原理，采用細胞免疫熒光染色法，觀察經(jīng)轉(zhuǎn)染6A8 cDNA的正義或反義DNA重組表達載體后，細胞結(jié)合Con A的強弱，探討6A8 cDNA編碼的蛋白質(zhì)是否為一種α-甘露糖苷酶。結(jié)果顯示COS 7細胞和人鼻咽癌細胞株CNE-2L2轉(zhuǎn)染pRc／CMV-正義6A8 DNA后與Con A結(jié)合減弱，而與單抗6A8染色增強；CNE-2L2細胞轉(zhuǎn)染pRc／CMV-反義6A8 DNA后，與Con A結(jié)合增強，而與單抗6A8染色減弱。而轉(zhuǎn)染空載pRc／CMV的CNE-2L2細胞和野生型細胞無明顯差別。上述結(jié)果表明6A8 cDNA編碼的蛋白質(zhì)可能為一種α-甘露糖等酶，，且能被單抗6A8識別。 本實驗室采用多組織Northern膜雜交表明，6A8基因在脾臟、淋巴結(jié)、胎肝中高表達，而在外周血白細胞、胸腺低表達。為進一步探討6A8 α-甘露糖苷酶mRNA在人免疫細胞中的表達情況，采用RT-PCR檢測多種人免疫細胞株中6A8 mRNA的表達，可見6A8 α-甘露糖苷酶mRNA在B細胞株SKW 6高表達，在B細胞株3D5、BJAB、CESS、Daudi、Nalm 6中度表達，在B細胞株Navamlva，T細胞株GM、Jurkat，組織細胞瘤細胞株U937弱表達，在T細胞株P(guān)eer，慢
【圖文】：

6A8cDNA的性質(zhì)初探掃描共聚焦顯微鏡U(tlima212，Meridina公司，usA)觀察細胞熒光RCclMV一正義6A8DNA或pRclcMv一反義6A8DNA后，細胞與合COS7細胞及CNE一2L2細胞轉(zhuǎn)染pRcC/Mv一正義6A8DNA后，相應細胞相比，細胞與單抗6A8的反應加強，而與ConA結(jié)合則減CNE一2L2細胞轉(zhuǎn)染pRcC/MV一反義6A8DNA后，細胞與單抗6A8而與CoAn結(jié)合增強(圖2)ABC

pRclCMV一反義6A8后對單抗6A8染色反應seofimmunofiuoerscencestainingwithonAbindinginCNE一2L2eellsatfertare6A8DNA.A，wild一ytPeeells;B，cellstransefetedwihtPRc/CMV一natisense6A8DNA3D5Jurkat
【學位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2000
【分類號】：R392

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本文編號：2598697