【摘要】：機(jī)體的蛋白質(zhì)大多以糖蛋白或稱糖復(fù)合物的形式存在。蛋白質(zhì)上的聚糖不僅對(duì)蛋白質(zhì)的折疊、成熟、裝配、穩(wěn)定性和降解、以及蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性等方面有著重要的調(diào)節(jié)作用，而且其本身作為一種信息分子，在細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-基質(zhì)、細(xì)胞-分子和分子-分子間的相互作用，以及細(xì)胞的活化、增殖、分化和死亡等方面都有著重要的作用。但蛋白質(zhì)糖基化和聚糖結(jié)構(gòu)的多樣性和復(fù)雜性使這方面的研究面臨重重困難。蛋白質(zhì)的糖基化是在多種糖�；D(zhuǎn)移酶和糖苷酶的催化下進(jìn)行的。編碼這些酶的基因的不斷發(fā)現(xiàn)和克隆對(duì)蛋白質(zhì)糖基化和聚糖的生物學(xué)意義的研究起到了積極的推動(dòng)作用，并得到了一些預(yù)想不到的結(jié)果。但迄今為止，有關(guān)這方面的研究進(jìn)展還很小。因此，亟待作出更多的努力，以揭示蛋白質(zhì)糖基化和聚糖的生物學(xué)意義，以及其作用產(chǎn)生和調(diào)節(jié)的規(guī)律。研究蛋白質(zhì)糖基化可采用多種方法，反義核苷酸技術(shù)即為其中之一。 我們從一個(gè)人扁桃體cDNA文庫中分離到了一個(gè)長(zhǎng)為1358 bp的cDNA(6A8)，此cDNA與編碼大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)α-甘露糖苷酶的基因有很高的同源性。α-甘露糖苷酶是一類蛋白質(zhì)糖基化加工過程中重要的糖苷酶，負(fù)責(zé)聚糖中甘露糖的修剪。因此，6A8 cDNA的分離使我們能夠介入蛋白質(zhì)糖基化與細(xì)胞功能的研究。本實(shí)驗(yàn)室的研究已發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染6A8 cDNA的反義DNA的人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2L2肺轉(zhuǎn)移率下降，運(yùn)動(dòng)性和侵襲性也受到抑制。本博士學(xué)位論文首先探討了6A8 cDNA的性質(zhì)，初步證明了其編碼一種α-甘露糖苷酶。然后構(gòu)建了腺相關(guān)病毒(AAV)載體pAGX(+)，并采用該載體介導(dǎo)6A8基因的正義和反義DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)入人淋巴細(xì)胞，研究干擾蛋白質(zhì)糖基化對(duì)淋巴細(xì)胞功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)導(dǎo)反義6A8 DNA引起人B細(xì)胞BJAB發(fā)生oncosis，而使人B細(xì)胞SKW6和T細(xì)胞Jurkat對(duì)凋亡誘導(dǎo)產(chǎn)生耐受。 首先，依據(jù)Con A的配體是甘露糖，而α-甘露糖苷酶的作用是修剪細(xì)胞糖蛋白聚糖中甘露糖的原理，采用細(xì)胞免疫熒光染色法，觀察經(jīng)轉(zhuǎn)染6A8 cDNA的正義或反義DNA重組表達(dá)載體后，細(xì)胞結(jié)合Con A的強(qiáng)弱，探討6A8 cDNA編碼的蛋白質(zhì)是否為一種α-甘露糖苷酶。結(jié)果顯示COS 7細(xì)胞和人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2L2轉(zhuǎn)染pRc／CMV-正義6A8 DNA后與Con A結(jié)合減弱，而與單抗6A8染色增強(qiáng)；CNE-2L2細(xì)胞轉(zhuǎn)染pRc／CMV-反義6A8 DNA后，與Con A結(jié)合增強(qiáng)，而與單抗6A8染色減弱。而轉(zhuǎn)染空載pRc／CMV的CNE-2L2細(xì)胞和野生型細(xì)胞無明顯差別。上述結(jié)果表明6A8 cDNA編碼的蛋白質(zhì)可能為一種α-甘露糖等酶，，且能被單抗6A8識(shí)別。 本實(shí)驗(yàn)室采用多組織Northern膜雜交表明，6A8基因在脾臟、淋巴結(jié)、胎肝中高表達(dá)，而在外周血白細(xì)胞、胸腺低表達(dá)。為進(jìn)一步探討6A8 α-甘露糖苷酶mRNA在人免疫細(xì)胞中的表達(dá)情況，采用RT-PCR檢測(cè)多種人免疫細(xì)胞株中6A8 mRNA的表達(dá)，可見6A8 α-甘露糖苷酶mRNA在B細(xì)胞株SKW 6高表達(dá)，在B細(xì)胞株3D5、BJAB、CESS、Daudi、Nalm 6中度表達(dá)，在B細(xì)胞株Navamlva，T細(xì)胞株GM、Jurkat，組織細(xì)胞瘤細(xì)胞株U937弱表達(dá)，在T細(xì)胞株P(guān)eer，慢
【圖文】：

6A8cDNA的性質(zhì)初探掃描共聚焦顯微鏡U(tlima212，Meridina公司，usA)觀察細(xì)胞熒光RCclMV一正義6A8DNA或pRclcMv一反義6A8DNA后，細(xì)胞與合COS7細(xì)胞及CNE一2L2細(xì)胞轉(zhuǎn)染pRcC/Mv一正義6A8DNA后，相應(yīng)細(xì)胞相比，細(xì)胞與單抗6A8的反應(yīng)加強(qiáng)，而與ConA結(jié)合則減CNE一2L2細(xì)胞轉(zhuǎn)染pRcC/MV一反義6A8DNA后，細(xì)胞與單抗6A8而與CoAn結(jié)合增強(qiáng)(圖2)ABC

pRclCMV一反義6A8后對(duì)單抗6A8染色反應(yīng)seofimmunofiuoerscencestainingwithonAbindinginCNE一2L2eellsatfertare6A8DNA.A，wild一ytPeeells;B，cellstransefetedwihtPRc/CMV一natisense6A8DNA3D5Jurkat
【學(xué)位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2000
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2598697