【摘要】：鈣網(wǎng)蛋白（Calreticulin，CRT）是一個(gè)定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的多功能蛋白，全長CRT具有416個(gè)氨基酸序列，約46kDa，N端有一個(gè)17個(gè)氨基酸的信號(hào)序列，C端有KDEL的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)序列。CRT具有N，P和C三個(gè)結(jié)構(gòu)域。其中P和C結(jié)構(gòu)域具有超強(qiáng)的結(jié)合Ca~(2+)能力，維持胞內(nèi)Ca~(2+)穩(wěn)態(tài)，參與Ca~(2+)介導(dǎo)的信號(hào)通路。此外，CRT在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中行使其分子伴侶的功能，通過N-domain的凝集素結(jié)合序列保證新合成蛋白的正確折疊。越來越多的證據(jù)表明CRT在細(xì)胞膜上也發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能，包括介導(dǎo)細(xì)胞粘附，參與凋亡細(xì)胞清除等。此外，病理狀況下體液中可溶性CRT的存在也屢見報(bào)道，包括自身免疫病、腫瘤等。 臨床以及實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)都提示CRT與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，主要體現(xiàn)在：1）CRT在腫瘤組織中高表達(dá)或在體液中出現(xiàn)對(duì)于腫瘤具有一定的輔助診斷價(jià)值；2）高表達(dá)CRT的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力更強(qiáng)；3）可溶性CRT抑制腫瘤血管新生；4）膜型CRT介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫原性死亡（immunogenic death）。本實(shí)驗(yàn)室的前期工作顯示，原核表達(dá)CRT片段39-272（rCRT/39-272）具有較強(qiáng)的免疫刺激活性及佐劑效應(yīng)。本課題的主要內(nèi)容是圍繞CRT與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，結(jié)合其對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用，利用中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞株考察可溶性CRT對(duì)細(xì)胞體內(nèi)成瘤性的影響并探索其機(jī)制。 我們構(gòu)建了eCRT/39-272的真核表達(dá)載體，并獲得了持續(xù)分泌eCRT/39-272的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，從培養(yǎng)上清中用鎳柱純化得到真核重組表達(dá)的eCRT/39-272。體外實(shí)驗(yàn)表明，eCRT/39-272可刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(PMC)分泌炎性因子TNF-α、IL-6，NO，且其發(fā)揮功能依賴于TLR4所介導(dǎo)的信號(hào)通路。 對(duì)持續(xù)分泌eCRT/39-272的CHO細(xì)胞株及其對(duì)照細(xì)胞株體外成瘤指標(biāo)考察發(fā)現(xiàn)分泌eCRT/39-272不影響CHO細(xì)胞體外的增殖速度、克隆形成能力，但增強(qiáng)了CHO細(xì)胞的粘附和遷移能力。與裸鼠皮下接種CHO-eCRT/39-272及其對(duì)照細(xì)胞CHO-EGFP， CHO-eCRT/39-272成瘤率顯著高于CHO-EGFP，且腫瘤體積比CHO-EGFP大約二倍。進(jìn)一步的研究表明裸鼠左右兩側(cè)皮下同時(shí)接種CHO-eCRT/39-272和CHO-EGFP，血清中存在的eCRT/39-272并不促進(jìn)CHO-EGFP腫瘤的生長。分析荷瘤小鼠外周血以及脾臟中的B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、骨髓來源的抑制細(xì)胞（MDSC）、自然殺傷細(xì)胞比例，發(fā)現(xiàn)并無明顯差異。對(duì)腫瘤組織局部浸潤的免疫細(xì)胞進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織局部的MDSC細(xì)胞比例顯著增加，提示其可能參與了體內(nèi)腫瘤的生長。同時(shí)對(duì)腫瘤組織局部進(jìn)行細(xì)胞因子表達(dá)檢測，發(fā)現(xiàn)與MDSC遷移相關(guān)的趨化因子CCL5上調(diào)，并且非免疫系統(tǒng)依賴的效應(yīng)分子金屬基質(zhì)蛋白酶MMP-2表達(dá)增加。 綜上所述，與前期描述的CRT作為血管抑素抑制腫瘤生長的作用不同，持續(xù)分泌表達(dá)eCRT/39-272的CHO細(xì)胞體內(nèi)成瘤性顯著增強(qiáng)，這種促腫瘤的作用可能與腫瘤局部高濃度eCRT/39-272促進(jìn)MDSC的募集相關(guān)。但是可溶性CRT介導(dǎo)的MDSC促進(jìn)腫瘤生長的具體機(jī)制及其對(duì)MDSC增殖分化的影響還需要進(jìn)一步研究。這一研究為更立體地看待CRT在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用提供了一個(gè)新的立足點(diǎn)。
【圖文】：

圖3-1 eCRT/39-272分泌型蛋白設(shè)計(jì)Figure 3-1 Design of eukaryotic CRT/39-272 protein A) plasmid profiles of pDisplay vector; B)plasmid profiles of pIRES2-EGFP vector; C) Schematic representation ofpIRES2-eCRT/39-272-EGFP construction. For expression of eCRT/39-272 protein, the MurineIgκ-chain leader sequence from pDisplay vector together with CRT/39-272 sequence, weresubcloned into pIRES2-EGFP vector.23

圖 3-2 pDisplay-eCRT/39-272 和 pIRES2-eCRT/39-272 載體的構(gòu)建Figure 3-2 Construction of pDisplay-eCRT/39-27 and pIRES2-eCRT/39-272 a) PCR product ofeCRT/39-272; (b) BglII SalI double digestion of the pDisplay-eCRT/39-272 plamid; (c) PCRproduct of soluble eCRT/39-272; (d) XhoI EcoRI double digestion of pIRES2-eCRT/39-272 plasmidAll the DNA products were run on 1% agarose gels with DNA ladders loaded in the left lane.3.2 pIRES2-eCRT/39-272 在 CHO 細(xì)胞中的表達(dá)為了檢測重組質(zhì)粒在體外能否有效表達(dá)，采用脂質(zhì)體（Lipofectamine-2000）轉(zhuǎn)染法將pIRES2-eCRT/39-272質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP質(zhì)粒做對(duì)照。轉(zhuǎn)染48h后，熒光顯微鏡下觀察表達(dá)EGFP熒光蛋白的細(xì)胞比例，，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pIRES2-eCRT/39-272和pIRES2-EGFP空質(zhì)粒效率均高達(dá)70%-80%（圖3-3）。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 王國勇;李程輝;張林;;肺腺癌組織中TTF-1、CRT表達(dá)變化及意義[J];山東醫(yī)藥;2013年08期

2 陳歆;蘇琦;;鈣網(wǎng)織蛋白與腫瘤[J];國際病理科學(xué)與臨床雜志;2012年06期

本文編號(hào)：2598643