【摘要】： 目的： 本研究擬從結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組中擴(kuò)增出ag85b、mpt64以及引入甘氨酸接頭連接的Ag85B-MPT64融合基因（AM），構(gòu)建DNA疫苗并探討其在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答和在小鼠結(jié)核感染模型中的保護(hù)作用，為新型結(jié)核病疫苗的研制奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為結(jié)核病的免疫防治提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1、用PCR和基因克隆技術(shù)從結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組中擴(kuò)增出Ag85B、MPT64編碼基因以及通過(guò)甘氨酸接頭連接的Ag85B-MPT64融合基因（AM），構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA/Ag85B、pcDNA/MPT64和pcDNA/AM，用酶切和雙向DNA測(cè)序進(jìn)行鑒定； 2、將MPT64、Ag85B編碼基因亞克隆入pET32a中，構(gòu)建pET/Ag85B和pET/MPT64原核表達(dá)質(zhì)粒，使其在大腸桿菌中表達(dá)并鑒定。用重組的MPT64和Ag85B蛋白免疫BABL/c小鼠， 制備MPT64 WP=9 與Ag85B抗血清。 3、將pcDNA3.1(+)、pcDNA/Ag85B、pcDNA/MPT64和pcDNA/AM轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，用RT-PCR、ELISA和斑點(diǎn)印跡的方法鑒定融合基因的表達(dá)。 4、用質(zhì)粒pcDNA3.1(+)、pcDNA/Ag85B、pcDNA/MPT64、pcDNA/AM和pcDNA/BM（經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶消化后粘粘連接的Ag85B-MPT64融合基因）免疫C57BL/6小鼠，采用 ELISA法測(cè)量免疫后相應(yīng)的PPD特異性抗體和脾淋巴細(xì)胞IL-4 以及IFN-γ分泌水平；MTT法檢測(cè)PPD特異性脾淋巴細(xì)胞增殖能力。 5、以重組質(zhì)粒免疫C57BL/6小鼠，末次免疫5周, BCG免疫100天后，用經(jīng)過(guò)動(dòng)物體內(nèi)恢復(fù)毒力的1×106CFU MTb.H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株由尾靜脈注射攻擊，以PBS組和空質(zhì)粒組作陰性對(duì)照、BCG組作陽(yáng)性對(duì)照；6周后分批處死動(dòng)物，測(cè)量PPD特異性抗體、PPD特異性脾淋巴細(xì)胞IL-4和IFN-γ分泌水平；觀察肺和脾組織器官荷菌量、組織抗酸染色、病理學(xué)改變以及小鼠存活時(shí)間。 結(jié)果： 1、經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切及DNA雙向測(cè)序證實(shí) pcDNA/MPT64、pcDNA/Ag85B序列與理論值一致，，pcDNA/AM堿基突變率為0.11%（2/1707），突變?yōu)闊o(wú)意義突變。 2、將MPT64、Ag85B編碼基因亞克隆入pET32a原核表達(dá)質(zhì)粒中，構(gòu)建的pET/ MPT64和pET/Ag85B在大腸桿菌中表達(dá)了具有生物學(xué)活性的重組MPT64和Ag85B蛋白。用重組蛋白制備的鼠抗 WP=10 MPT64與Ag85B血清效價(jià)分別為1:32和1:64。 3、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后，分別用MPT64、Ag85B多克隆抗體通過(guò)ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液，抗MPT64與pcDNA/MPT64、抗Ag85B與pcDNA/Ag85B呈陽(yáng)性反應(yīng)，pcDNA/AM組與抗MPT64和抗Ag85B均呈陽(yáng)性反應(yīng)；對(duì)照組均為陰性反應(yīng)。 4、將PBS、pcDNA3.1、pcDNA/Ag85B、pcDNA/MPT64、pcDNA/AM和pcDNA/BM免疫C57BL/6小鼠，末次免疫4周后，實(shí)驗(yàn)組PPD特異性抗體水平均有不同程度增高，以pcDNA/Ag85B+pcDNA/MPT64、pcDNA/AM組最高（P0.05）；脾淋巴細(xì)胞經(jīng)過(guò)PPD刺激后， IFN-γ分泌水平以及脾淋巴細(xì)胞增殖能力pcDNA/Ag85B+pcDNA/MPT64、pcDNA/AM組和pcDNA/BM組明顯高于其他組（P0.05），pcDNA/AM組高于pcDNA/BM組（P0.05），pcDNA/Ag85B+pcDNA/MPT64組與pcDNA/AM組之間差異無(wú)顯著性（P0.05）。 5、用H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株攻擊小鼠后6周，BCG、pcDNA/Ag85B、pcDNA/MPT64、pcDNA/Ag85B+pcDNA/MPT64、pcDNA/BM和pcDNA/AM組IFN-γ分泌水平以及脾淋巴細(xì)胞增殖能力均有不同程度增高，以BCG組最高，pcDNA/Ag85B+pcDNA/MPT64和pcDNA/AM組次之，pcDNA3.1和PBS組最低，但pcDNA/Ag85B+pcDNA/MPT64和pcDNA/AM組的差異無(wú)顯著性（P0.05）。各組均未檢測(cè)到IL-4的分泌。 6、肺、脾荷菌量以BCG組最低（P0.01），混合質(zhì)粒組和AM免疫 WP=11 組次之；但混合質(zhì)粒組和AM免疫組之間差異無(wú)顯著性（P0.05），AM與BM DNA免疫組之間有顯著性差異（P0.05）。 7、用H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株攻擊小鼠后6周，肺組織病理改變：陰性對(duì)照組的改變，主要為大量的漿液纖維素性和少量的淋巴細(xì)胞滲出以及不同程度的肺組織壞死；陽(yáng)性對(duì)照組主要表現(xiàn)為大量的淋巴細(xì)胞、組織細(xì)胞和類上皮細(xì)胞浸潤(rùn)以及結(jié)核肉芽腫的形成；以混合質(zhì)粒組和AM免疫組病變和陽(yáng)性對(duì)照組最為接近，其他各組介于BM組和陰性對(duì)照之間。脾組織的病理改變主要是炎性浸潤(rùn)和淋巴細(xì)胞的增生，陰性對(duì)照組主要表現(xiàn)為炎性浸潤(rùn)，陽(yáng)性對(duì)照組主要表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞的增生，混合質(zhì)粒組和AM免疫組病變與BCG組相似，其余各組介于BM與陰性對(duì)照組之間。 8、小鼠存活時(shí)間以BCG組最長(zhǎng)，混合質(zhì)粒組和pcDNA/AM組次之，pcDNA3.1和PBS組最短。 結(jié)論： 1、pcDNA/Ag85B、pcDNA/MPT64和pcDNA/AM DNA疫苗構(gòu)建成功；pET/Ag85B、pET/MPT64能在大腸桿菌中表達(dá)，并分離純化出rAg85B、rMPT64重組蛋白。 2、pcDNA/Ag85B、pcDNA/MPT64和pcDNA/AM能在COS-7細(xì)胞中分泌表達(dá)，且表達(dá)的蛋白具有免疫反應(yīng)性。 3、本研究構(gòu)建的DNA疫苗均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性體液免疫和細(xì)胞免疫，其誘導(dǎo)能力以pcDNA/Ag85B+pcDNA/MPT64和pcDNA/AM組最強(qiáng)，而pcDNA/AM組優(yōu)于pcDNA/BM組。 WP=12 4、免疫小鼠經(jīng)H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株攻擊后，PPD特異性抗體以pcDNA/Ag85B+pcDNA/MPT64和pcDNA/AM組最高； IFN-γ分泌水平以及脾淋巴細(xì)胞增殖能力以BCG、pcDNA/Ag85B+pcDNA/MPT64和pcDNA/AM組最高。提示DNA疫苗接種后可以通過(guò)提高特異性體液免疫和細(xì)胞免疫水平發(fā)揮抗感染作用。 5、組
【圖文】：

31圖 1-2 質(zhì)粒 pcDNA/MPT64 構(gòu)建的技術(shù)路線Fig1-2 Procedure for construction of plasmid pcDNA/MPT64三 構(gòu)建質(zhì)粒 pcDNA/AM

32圖 1-3 Ag85B 和 MPT64 融合基因Fig1-3. Procedure for construction of the Ag85B and MPT64 AM2 pcDNA/AM 構(gòu)建技術(shù)路線(Fig1-4.)
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R392

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2598263