【摘要】： 目的： 本研究擬從結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組中擴增出ag85b、mpt64以及引入甘氨酸接頭連接的Ag85B-MPT64融合基因（AM），構(gòu)建DNA疫苗并探討其在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答和在小鼠結(jié)核感染模型中的保護作用，為新型結(jié)核病疫苗的研制奠定基礎(chǔ)，同時也為結(jié)核病的免疫防治提供理論和實驗依據(jù)。 方法： 1、用PCR和基因克隆技術(shù)從結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組中擴增出Ag85B、MPT64編碼基因以及通過甘氨酸接頭連接的Ag85B-MPT64融合基因（AM），構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pcDNA/Ag85B、pcDNA/MPT64和pcDNA/AM，用酶切和雙向DNA測序進行鑒定； 2、將MPT64、Ag85B編碼基因亞克隆入pET32a中，構(gòu)建pET/Ag85B和pET/MPT64原核表達質(zhì)粒，使其在大腸桿菌中表達并鑒定。用重組的MPT64和Ag85B蛋白免疫BABL/c小鼠， 制備MPT64 WP=9 與Ag85B抗血清。 3、將pcDNA3.1(+)、pcDNA/Ag85B、pcDNA/MPT64和pcDNA/AM轉(zhuǎn)染COS-7細胞，用RT-PCR、ELISA和斑點印跡的方法鑒定融合基因的表達。 4、用質(zhì)粒pcDNA3.1(+)、pcDNA/Ag85B、pcDNA/MPT64、pcDNA/AM和pcDNA/BM（經(jīng)過限制性內(nèi)切酶消化后粘粘連接的Ag85B-MPT64融合基因）免疫C57BL/6小鼠，采用 ELISA法測量免疫后相應(yīng)的PPD特異性抗體和脾淋巴細胞IL-4 以及IFN-γ分泌水平；MTT法檢測PPD特異性脾淋巴細胞增殖能力。 5、以重組質(zhì)粒免疫C57BL/6小鼠，末次免疫5周, BCG免疫100天后，用經(jīng)過動物體內(nèi)恢復(fù)毒力的1×106CFU MTb.H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株由尾靜脈注射攻擊，以PBS組和空質(zhì)粒組作陰性對照、BCG組作陽性對照；6周后分批處死動物，測量PPD特異性抗體、PPD特異性脾淋巴細胞IL-4和IFN-γ分泌水平；觀察肺和脾組織器官荷菌量、組織抗酸染色、病理學(xué)改變以及小鼠存活時間。 結(jié)果： 1、經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切及DNA雙向測序證實 pcDNA/MPT64、pcDNA/Ag85B序列與理論值一致，，pcDNA/AM堿基突變率為0.11%（2/1707），突變?yōu)闊o意義突變。 2、將MPT64、Ag85B編碼基因亞克隆入pET32a原核表達質(zhì)粒中，構(gòu)建的pET/ MPT64和pET/Ag85B在大腸桿菌中表達了具有生物學(xué)活性的重組MPT64和Ag85B蛋白。用重組蛋白制備的鼠抗 WP=10 MPT64與Ag85B血清效價分別為1:32和1:64。 3、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細胞后，分別用MPT64、Ag85B多克隆抗體通過ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液，抗MPT64與pcDNA/MPT64、抗Ag85B與pcDNA/Ag85B呈陽性反應(yīng)，pcDNA/AM組與抗MPT64和抗Ag85B均呈陽性反應(yīng)；對照組均為陰性反應(yīng)。 4、將PBS、pcDNA3.1、pcDNA/Ag85B、pcDNA/MPT64、pcDNA/AM和pcDNA/BM免疫C57BL/6小鼠，末次免疫4周后，實驗組PPD特異性抗體水平均有不同程度增高，以pcDNA/Ag85B+pcDNA/MPT64、pcDNA/AM組最高（P0.05）；脾淋巴細胞經(jīng)過PPD刺激后， IFN-γ分泌水平以及脾淋巴細胞增殖能力pcDNA/Ag85B+pcDNA/MPT64、pcDNA/AM組和pcDNA/BM組明顯高于其他組（P0.05），pcDNA/AM組高于pcDNA/BM組（P0.05），pcDNA/Ag85B+pcDNA/MPT64組與pcDNA/AM組之間差異無顯著性（P0.05）。 5、用H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株攻擊小鼠后6周，BCG、pcDNA/Ag85B、pcDNA/MPT64、pcDNA/Ag85B+pcDNA/MPT64、pcDNA/BM和pcDNA/AM組IFN-γ分泌水平以及脾淋巴細胞增殖能力均有不同程度增高，以BCG組最高，pcDNA/Ag85B+pcDNA/MPT64和pcDNA/AM組次之，pcDNA3.1和PBS組最低，但pcDNA/Ag85B+pcDNA/MPT64和pcDNA/AM組的差異無顯著性（P0.05）。各組均未檢測到IL-4的分泌。 6、肺、脾荷菌量以BCG組最低（P0.01），混合質(zhì)粒組和AM免疫 WP=11 組次之；但混合質(zhì)粒組和AM免疫組之間差異無顯著性（P0.05），AM與BM DNA免疫組之間有顯著性差異（P0.05）。 7、用H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株攻擊小鼠后6周，肺組織病理改變：陰性對照組的改變，主要為大量的漿液纖維素性和少量的淋巴細胞滲出以及不同程度的肺組織壞死；陽性對照組主要表現(xiàn)為大量的淋巴細胞、組織細胞和類上皮細胞浸潤以及結(jié)核肉芽腫的形成；以混合質(zhì)粒組和AM免疫組病變和陽性對照組最為接近，其他各組介于BM組和陰性對照之間。脾組織的病理改變主要是炎性浸潤和淋巴細胞的增生，陰性對照組主要表現(xiàn)為炎性浸潤，陽性對照組主要表現(xiàn)為淋巴細胞的增生，混合質(zhì)粒組和AM免疫組病變與BCG組相似，其余各組介于BM與陰性對照組之間。 8、小鼠存活時間以BCG組最長，混合質(zhì)粒組和pcDNA/AM組次之，pcDNA3.1和PBS組最短。 結(jié)論： 1、pcDNA/Ag85B、pcDNA/MPT64和pcDNA/AM DNA疫苗構(gòu)建成功；pET/Ag85B、pET/MPT64能在大腸桿菌中表達，并分離純化出rAg85B、rMPT64重組蛋白。 2、pcDNA/Ag85B、pcDNA/MPT64和pcDNA/AM能在COS-7細胞中分泌表達，且表達的蛋白具有免疫反應(yīng)性。 3、本研究構(gòu)建的DNA疫苗均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性體液免疫和細胞免疫，其誘導(dǎo)能力以pcDNA/Ag85B+pcDNA/MPT64和pcDNA/AM組最強，而pcDNA/AM組優(yōu)于pcDNA/BM組。 WP=12 4、免疫小鼠經(jīng)H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株攻擊后，PPD特異性抗體以pcDNA/Ag85B+pcDNA/MPT64和pcDNA/AM組最高； IFN-γ分泌水平以及脾淋巴細胞增殖能力以BCG、pcDNA/Ag85B+pcDNA/MPT64和pcDNA/AM組最高。提示DNA疫苗接種后可以通過提高特異性體液免疫和細胞免疫水平發(fā)揮抗感染作用。 5、組
【圖文】：

31圖 1-2 質(zhì)粒 pcDNA/MPT64 構(gòu)建的技術(shù)路線Fig1-2 Procedure for construction of plasmid pcDNA/MPT64三 構(gòu)建質(zhì)粒 pcDNA/AM

32圖 1-3 Ag85B 和 MPT64 融合基因Fig1-3. Procedure for construction of the Ag85B and MPT64 AM2 pcDNA/AM 構(gòu)建技術(shù)路線(Fig1-4.)
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：R392

【共引文獻】

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本文編號：2598263