【摘要】：[背景與目的] 葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(Grp78)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的分子伴侶,是熱休克蛋白70家族的成員之一,Grp78參與未折疊蛋白反應(yīng)(UPR),在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮十分重要的作用。應(yīng)激狀態(tài)下,如感染、缺氧、營養(yǎng)剝奪、毒性物質(zhì)刺激等,Grp78在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的表達(dá)有助于蛋白質(zhì)分子的正確折疊,維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)定；細(xì)胞核及胞漿中的Grp78可促進(jìn)抗凋亡分子的表達(dá),阻止凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)。課題組前期工作證明,增加Grp78在胰島p細(xì)胞的表達(dá)不僅可以保護(hù)胰島p細(xì)胞抵抗凋亡,同時(shí)還可誘導(dǎo)免疫負(fù)調(diào)T細(xì)胞的形成,參與免疫調(diào)節(jié),但免疫負(fù)調(diào)T細(xì)胞誘導(dǎo)形成的機(jī)制尚不清楚。但由于Grp78蛋白本身并不具備跨膜區(qū)域,因此推測Grp78也可能被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜外,以分泌型的形式表達(dá)。2009年,Kern J等在研究bortezomib的抗血管生成作用時(shí)發(fā)現(xiàn),多種實(shí)體瘤細(xì)胞系,如MCF-7、PC-3、HRT-18等,能分泌一種可溶性因子保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞抵抗bortezomib的損傷,經(jīng)分析證實(shí)該可溶性因子正是Grp78。說明在應(yīng)激狀態(tài)下,細(xì)胞不僅提高Grp78的胞內(nèi)表達(dá)抵抗凋亡,同時(shí)還能將Grp78分泌至胞外微環(huán)境中,調(diào)節(jié)周圍細(xì)胞的功能。近年來,有研究報(bào)道分泌型Grp78可以影響樹突狀細(xì)胞(DC)的發(fā)育。DC是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞(APC),在免疫應(yīng)答及啟動(dòng)抗腫瘤免疫反應(yīng)中均起著關(guān)鍵作用。人體內(nèi)DC處于不同成熟狀態(tài),未成熟DC表達(dá)低水平的共刺激分子和粘附分子,提呈抗原能力較弱,體外激發(fā)同種混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的能力較低；但未成熟DC具有極強(qiáng)的抗原吞噬能力,在攝取抗原(包括體外加工)或受到某些因素刺激時(shí)可分化為成熟DC,刺激T細(xì)胞,誘導(dǎo)免疫正應(yīng)答。前期課題組研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Grp78具有免疫負(fù)調(diào)作用,其作用是否通過調(diào)節(jié)DC的成熟參與負(fù)調(diào)T細(xì)胞功能尚待探討。基于此,本博士學(xué)位論文課題研究在前期純化獲得小鼠重組Grp78的基礎(chǔ)上,分別將LPS和Grp78添加至BMMC培養(yǎng)體系中,探討Grp78對(duì)BMMC誘導(dǎo)分化以及DC生成分化成熟的影響,并進(jìn)一步鑒定其生物學(xué)功能,旨在為深入研究Grp78在免疫調(diào)節(jié)中的作用奠定基礎(chǔ)。 [方法] 1.Grp78的表達(dá)與純化 將課題組已構(gòu)建的pGEX-4T-3-Grp78質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,IPTG誘導(dǎo)大量表達(dá),提取可溶性蛋白,通過GST Spin Purification Kit純化,將收集的目的蛋白放入30KB的超濾管中,3000G10min,加入10mlPBS多次離心,用BCA試劑盒檢測蛋白濃度后,-80℃保存?zhèn)溆谩?2.小鼠骨髓來源DC的誘導(dǎo)培養(yǎng) 從Balb/c小鼠股骨中分離骨髓來源的單個(gè)核細(xì)胞(Bone marrow mononuclear cells, BMMC),加入約16ml完全培養(yǎng)基(1640+10%胎牛血清),輕輕吹打混勻,轉(zhuǎn)入24孔培養(yǎng)板中,2ml/孔,添加青霉素/鏈霉素,終濃度為100U/ml, GM-CSF終濃度10ng/ml, IL-4終濃度10ng/ml,37℃,5%CO2溫箱培養(yǎng)7天,流式細(xì)胞術(shù)檢查CD11c分子的表達(dá)。 3. LPS-DC, Grp78-DC, Grp78-LPS-DC的誘導(dǎo)培養(yǎng) 上述誘導(dǎo)培養(yǎng)的DC每2天半量換液一次,并設(shè)立不同實(shí)驗(yàn)組：①Control組；②LPS組：第7日棄上清加1ml培養(yǎng)基,加入LPS(終濃度500ng/ml)刺激12h后收獲細(xì)胞,命名為LPS-DC;③Grp78組：培養(yǎng)第1天開始加純化的rmGrp78蛋白(終濃度10μg/ml),命名為Grp78-DC;④Grp78+LPS組：第1天開始加純化的mGrp78蛋白,并于第7天換液加LPS,刺激12h后收獲細(xì)胞,命名為Grp78-LPS-DC。上述各組于第3日,第5日半量換液,第7日棄上清加約1ml培養(yǎng)基。 4.小鼠骨髓來源LPS-DC, Grp78-DC, Grp78-LPS-DC表面標(biāo)志的檢測 取上述培養(yǎng)的細(xì)胞,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測CDllc+細(xì)胞表面I-A/E、 CD80/CD86、CD83、CD40、B7-H3/4等分子的表達(dá)。 5.不同組誘導(dǎo)小鼠BMMC分泌細(xì)胞因子的檢查 收集上述各組細(xì)胞培養(yǎng)上清,采用ELISA檢測TNF-α、IFN-γ、IL-10等細(xì)胞因子的分泌。 7.不同組誘導(dǎo)小鼠BMMC分泌HMGB1、NO的檢查 收集上述各組細(xì)胞培養(yǎng)上清,采用ELISA檢測HMGB1、NO的分泌。 8.小鼠骨髓來源不同組DC培養(yǎng)后葡聚糖攝取能力的鑒定 取上述培養(yǎng)的細(xì)胞,加入PE-dextran,37℃孵育1h,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測CDllc+細(xì)胞葡聚糖攝取能力。 9.不同組誘導(dǎo)小鼠BMMC培養(yǎng)后COX-2、ARG1、iNOS等分子mRNA的檢測 從Balb/c小鼠中分離BMMC,于第8日相應(yīng)組加入LPS后5h收獲細(xì)胞,提取mRNA,逆轉(zhuǎn)錄后,采用RT-PCR檢測細(xì)胞內(nèi)COX-2、ARG1、iNOS等mRNA的表達(dá)。 10.不同組誘導(dǎo)小鼠BMMC培養(yǎng)后細(xì)胞因子mRNA的檢測 從Balb/c小鼠中分離BMMC,于第8日相應(yīng)組加入LPS后5h收獲細(xì)胞,提取mRNA,逆轉(zhuǎn)錄后,采用RT-PCR檢測細(xì)胞內(nèi)TNF-α、TGF-β、IL-6、iNOS、 IL-10、IL-4、IL-12等因子mRNA的表達(dá)。 11.不同組小鼠BMMC誘導(dǎo)脾臟來源T細(xì)胞的特征分析 將收獲的各組BMMC與同系小鼠脾臟來源的T細(xì)胞共培養(yǎng)(BMMC:T細(xì)胞=1：10),培養(yǎng)體系中添加IL-2(200U/ml)、抗小鼠CD3單克隆抗體(0.3μg/ml),共培養(yǎng)5天后,采用流式細(xì)胞術(shù)比較各組CD4+細(xì)胞中CD25+Foxp3+細(xì)胞百分比差異。 12.不同組誘導(dǎo)DC輸注小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)T細(xì)胞特征分析 用NIT細(xì)胞負(fù)載Grp78誘導(dǎo)的BMMC,磁珠分選CDllc+細(xì)胞,然后輸注Balb/c小鼠(5×106細(xì)胞／只),每周一次,共3次,最后一次輸注后10天,處死小鼠,取淋巴結(jié)、血液中淋巴細(xì)胞,分析CD4+細(xì)胞中CD25+Foxp3+細(xì)胞百分比;取脾臟中淋巴細(xì)胞分析CD4+CD25+Foxp3+T, CD4+IL-17+T, CD4+IL-4+T, CD4+IL-10+T及CD4+IFN-γ+T細(xì)胞百分比。 [結(jié)果] 1.Grp78對(duì)BMMC誘導(dǎo)分化的影響 與對(duì)照組相比,Grp78的添加能顯著抑制BMMC分化為CDllc+細(xì)胞(P=0.003),且隨著Grp78濃度的升高,CDllc+細(xì)胞比例逐漸降低,呈劑量依賴性；進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面CDllb與Grl標(biāo)志,結(jié)果顯示Grp78組以及Grp78+LPS組髓系抑制性細(xì)胞(Myeloid-derived suppressor cells, MDSC)形成的百分比升高,且隨著Grp78濃度的升高,MDSC比例逐漸升高。提示Grp78參與負(fù)性調(diào)節(jié)作用與抑制CDllc+細(xì)胞分化及促進(jìn)MDSC形成有關(guān)。 2.鼠骨髓來源LPS-DC, Grp78-DC,Grp78-LPS-DC表面I-A/E分子的表達(dá) 結(jié)果顯示Grp78-DC、Grp78-LPS-DC表面的I-A/E表達(dá)較LPS-DC表達(dá)明顯下降(P0.01)。 3.小鼠骨髓來源LPS-DC, Grp78-DC, Grp78-LPS-DC表面分子的表達(dá) 與LPS-DC相比,Grp78-DC, Grp78-LPS-DC表面DC活化標(biāo)志分子CD83的表達(dá)顯著降低(P=0.011),同時(shí)共刺激分子CD40、CD86的表達(dá)下調(diào),而共抑制分子B7-H3、B7-H4的表達(dá)上調(diào); 4.不同組誘導(dǎo)小鼠BMMC細(xì)胞因子的表達(dá) Grp78誘導(dǎo)的BMMC的NO分泌降低,HMGB1、TGF-β分泌無影響；在mRNA水平,Grp78誘導(dǎo)的BMMC中COX-2的表達(dá)降低。 5.不同組誘導(dǎo)小鼠BMMC培養(yǎng)后細(xì)胞因子的表達(dá) Grp78誘導(dǎo)的BMMC分泌IL-10增加,IFN-γ、TNF-α分泌降低,TGF-β分泌無影響；在mRNA水平,Grp78誘導(dǎo)的BMMC降低炎性因子TNF-α的表達(dá)。 6.小鼠骨髓來源LPS-DC, Grp78-DC, Grp78-LPS-DC葡聚糖攝取能力 Grp78-DC和Grp78-LPS-DC攝取葡聚糖的能力顯著高于LPS-DC, Grp78誘導(dǎo)的CDllc+細(xì)胞對(duì)于葡聚糖的攝取率增加13%,提示Grp78誘導(dǎo)CD11c+細(xì)胞維持葡聚糖的強(qiáng)攝取能力。 7.小鼠BMMC誘導(dǎo)脾臟來源T細(xì)胞的特征 與同系小鼠脾臟來源的T細(xì)胞共培養(yǎng),Grp78誘導(dǎo)的BMMC能誘導(dǎo)CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞生成,比率明顯高于對(duì)照組(P=0.009)。 8.小鼠骨髓來源不同組DC分別輸注小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)T細(xì)胞特征 NIT凍融物負(fù)載各組CDllc+細(xì)胞輸注Balb/c小鼠,處死小鼠后,取脾臟、淋巴結(jié)、血液中淋巴細(xì)胞,分析T細(xì)胞的特征。結(jié)果顯示,淋巴結(jié)內(nèi)小鼠CD4+T細(xì)胞的百分比無明顯差異,Grp78-DC輸注組CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞百分率明顯增加(P0.05)；血液中各組小鼠CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的百分比無明顯差異(P0.05),脾臟中各組小鼠CD4+CD25+Foxp3+T, CD4+IL-17+T, CD4+IL-4+T, CD4+IL-10+T及CD4+IFN-γ+T細(xì)胞的百分比無明顯差異(P0.05)。 [結(jié)論] 本課題首次探討了Grp78對(duì)小鼠BMMC誘導(dǎo)分化的影響,以及對(duì)骨髓來源DC分化成熟的影響,并初步探討了其功能,通過與Control組、LPS誘導(dǎo)組比較,研究結(jié)果表明：①Grp78抑制BMMC向DC分化,而促進(jìn)向MDSC分化,其作用可能與Grp78免疫負(fù)性調(diào)節(jié)功能有關(guān)；②Grp78誘導(dǎo)的CD11c+細(xì)胞仍維持較強(qiáng)的抗原攝取能力,但細(xì)胞表面I-A/E分子及共刺激分子的表達(dá)下調(diào),共抑制分子表達(dá)上調(diào)；炎性因子分泌降低,IL-10分泌增加；提示Grp78誘導(dǎo)的CD11c+細(xì)胞具備耐受性DC的表型；③與同系小鼠脾臟來源的T細(xì)胞共培養(yǎng),Grp78誘導(dǎo)的BMMC誘導(dǎo)具有Treg細(xì)胞特征的細(xì)胞明顯高于對(duì)照組；④體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明,Grp78-DC輸注,小鼠淋巴結(jié)內(nèi)CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞顯著高于其他DC組,上述結(jié)果提示Grp78-DC和Grp78-LPS-DC具有耐受性DC特征。
【圖文】：
華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文 C：不同濃度Grp78對(duì)BMDC分化為CD】lc+細(xì)胞影響的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果(**:P<0.01, *： P<0.05, NS： P>0.05,本實(shí)驗(yàn)重復(fù) 5 次）由上述結(jié)果可見，Grp78可抑制BMMC向CDnc+細(xì)胞分化。為了研究Grp78對(duì)其它抑制性細(xì)胞，如MDSC分化的影響，進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)檢測Grp78誘導(dǎo)后的BMMC細(xì)胞中CDllb+Grl+細(xì)胞百分比，結(jié)果顯示隨著Grp78濃度的升高，CDllb+Grl+細(xì)胞百分比逐漸升高，提示Grp78可促進(jìn)BMMC向CDllb+Grl+的MDSC方向分化（圖1-2), MDSC的形成可能與Grp78參與負(fù)性調(diào)節(jié)作用有關(guān)。A
圖3 Grp78處理的CD11C+細(xì)胞表面共刺激分子表達(dá)降低并共抑制分子的表達(dá)升高Figure 3 Grp78 can reduce expression of costimulatory molecules and enhanceexpression of inhibitory molecules on CDllc+ cells.圖3A:不同組CDllc+DC表面共刺激分子和共抑制分子表達(dá)FCM圖圖3B:不同組CDllc+DC表面共刺激分子和共抑制分子表達(dá)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果（**:/'<0.01, *： P<0.05, NS： P>0.05,本實(shí)驗(yàn)重復(fù) 5 次）四、不同組誘導(dǎo)小鼠BMMC細(xì)胞因子的表達(dá)收集上述各組細(xì)胞培養(yǎng)上清，懫用ELISA檢測TNF-ot、IFN-y> IL-10、TGF-p等細(xì)胞因子的分泌，圖4結(jié)果顯示Grp78處理的BMMC可增加IL-10分泌（/><0.05)，降低TOF-a的表達(dá)（PCO.Ol),對(duì)IFN-y、TGF-p的表達(dá)無顯著影響。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R392
【共引文獻(xiàn)】
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本文編號(hào)：
2596488
