【摘要】： 促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)是由下丘腦神經元分泌的一種含有十個氨基酸的肽類激素，經下丘腦-垂體-門脈系統(tǒng)進入垂體前葉，作用于垂體前葉的促性腺激素分泌細胞，刺激卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)和黃體生成素(luteinizing hormone，LH)的分泌，從而調節(jié)性腺的發(fā)育與配子的形成。已有大量證據表明，GnRH及其受體可廣泛存在于下丘腦-垂體軸之外，如免疫系統(tǒng)(T、B淋巴細胞)、生殖系統(tǒng)(卵巢、輸卵管、前列腺、睪丸及胎盤等處)以及一些惡性腫瘤(乳腺癌、肺癌、胰腺癌及肝癌等)，對這些組織和器官及惡性腫瘤的生長起調控作用。 我們先前的研究表明，在大鼠的消化系統(tǒng)廣泛存在有GnRH及其受體，并且其受體的基因序列與垂體的基因序列一致，說明大鼠的消化系統(tǒng)能自身合成GnRH及其受體，同時這些組織或細胞是GnRH作用的靶細胞，如GnRH類似物可明顯促進大鼠頜下腺對神經生長因子的分泌。那么，在培養(yǎng)的大鼠胃平滑肌細胞、胃粘膜壁細胞是否存在有GnRH及其受體，其GnRH的基因序列怎樣?GnRH對它們的功能影響如何?均未見報道。因此我們 第囚軍匡大學謬玄學伍淪文 在先前研究的基礎上，進行了以下研究：D」首先對大鼠的胃平滑肌細胞 進行了分離培養(yǎng)及鑒定，并采用免疫細胞化學、原位雜交技術在培養(yǎng)的平 滑肌細胞上原位檢測GnRH受體的表達；［2］運用放射免疫分析法檢測了 GnRH類似物對大鼠胃平滑肌細胞PKC酶活性的影響，然后運用激光共聚 焦技術檢測了GnRH類似物對胃平滑肌細胞內Ca’”濃度的影響，以探討胃 平滑肌細胞內 GnRH受體介導的信號轉導機制：［3］GnRH類似物對培養(yǎng)的 胃平滑肌細胞處理后，分別采用＊T比色法、’H－TdR摻入法、檢測PCNA 法和流式細胞儀技術觀察GnRH類似物對平滑肌細胞增殖情況及細胞周期 分布的影響：「d對大鼠的胃壁細胞進行了分離培養(yǎng)及鑒定，運用形態(tài)學 研究的方法檢測了GnRH及其受體在培養(yǎng)的胃壁細胞上的分布，并運用 RT－PCR、基因克隆測序等技術對壁細胞分泌的GnRH基因序列進行了研究； ［5］ 用激光共聚焦技術檢測GnRH類似物對培養(yǎng)的大鼠胃壁細胞內Ca’”濃 度的影響，同時檢測了GnRH類似物對在體大鼠胃酸分泌的作用，進一步 了解GnRH對消化系統(tǒng)功能的調節(jié)，為先前提出GnRH也是一種胃腸激素 的新觀點提供更直接的實驗依據。 主要研究結果如下： 1．運用免疫細胞化學和原位雜交的方法發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)的大鼠胃平滑肌 細胞含有GnRH受體免疫反應陽性物質，同樣含有GnRH受體InRNA雜 交信號，二者均位于細胞漿內，胞核為陰性，說明培養(yǎng)的胃平滑肌細胞能 表達GnRH受體，是Gs作用的靶細胞。 2．運用放射性同位素的方法檢測了GnRH類似物（阿拉瑞林）對大鼠 胃平滑肌細胞PKC ＆活性的影響，發(fā)現(xiàn)阿拉瑞林可使培養(yǎng)的大鼠胃平滑肌 細胞中PKC活性明顯升高，3Inin時達高峰，10Inin后作用明顯降低，且 成劑量依賴性；同時發(fā)現(xiàn)在無外CaZ”時，，阿拉瑞林也可使PKC活性升高， ．5－ 第回軍皿大學傅士學伍論文 但不如有外鈣存在時高o＜0．05卜因此PKC活性的增高，并不完全依賴細 胞外C八 它可以動員胞內＊“的釋放激活PKC。 3．阿拉瑞林可使胞內叨”濃度升高，說明＊”參與了GnRH類似 物阿拉瑞林對胃平滑肌細胞作用的細胞內分子轉導過程，而細胞內＊擴 的升高既源于細胞內鈣的釋放又源于細胞外鈣的內流，外鈣的內流主要是 通過L－type鈣通道實現(xiàn)的，內鈣的釋放不是通過RyRs受體，而是通過IP3 受體實現(xiàn)的。 4．細胞的增殖實驗表明，隨著阿拉瑞林濃度的增大，與未用藥的對 照組相比，發(fā)現(xiàn)其M17’吸光度K值）逐漸降低（＜0刀5）；P CNCNA表達的平 均熒光值逐漸減弱o＜0刀5）：大鼠胃平滑肌細胞的’付＊皿參入量依次減 少（P＜（、05卜 且藥物濃度越大，此三者下降越明顯。在細胞周期中，與對 照組相比，GI期細胞所占比例明顯增加（P＜．05h S期細胞所占比例明顯 減少，且隨藥物濃度的增加而逐漸減少o＜0刀5卜說明＊nRH類似物可明 顯抑制大鼠胃平滑肌細胞的增殖作用，其作用途徑可能是通過平滑肌細胞 自身GnRH受體的直接介導而實現(xiàn)的。 5．運用細胞培養(yǎng)技術對大鼠的胃粘膜壁細胞進行了分離與培養(yǎng)，然 后采用形態(tài)學的研究方法，研究了GnRH及其受體在大鼠胃粘膜壁細胞中 的表達，發(fā)現(xiàn)胃粘膜壁細胞中含有GnRH蛋白和GnRll－mRNA，H者均定位 于細胞漿內，并且發(fā)現(xiàn)GnRH受體蛋白及其GnRH受體的IuRNA也定位于細 胞漿內，這提示大鼠胃粘膜壁細胞可自身合成和分泌GnRH，在胃粘膜壁 細胞GDRH可能以自分泌的方式調節(jié)壁細胞的功能。 6．我們從培養(yǎng)的大鼠壁細胞中提取總RNA，應用RT－PCR的方法擴 增Gngu基因，并對產洲行純化回收，連接入pUC19 ＆體中擴增，經eR 和酶切鑒定后進行序列分析。結果發(fā)現(xiàn)胃壁細胞中GnRH的基因序列與下 丘腦的完全一致。 ．6．
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2002
【分類號】：R329

【參考文獻】

相關期刊論文 前9條

1 金花淑,黃威權,張金山,文永植,張崇理;大鼠頜下腺促性腺激素釋放激素及其mRNA的免疫組織化學與原位雜交研究[J];動物學報;1998年02期

2 王關嵩,錢桂生,楊曉靜,陳維中;2種酶消化法培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細胞生長特性的比較[J];第三軍醫(yī)大學學報;1999年10期

3 張金山,黃高升,黃威權,張遠強;GnRH及其受體表達與肝癌細胞增殖和分化的關系[J];第四軍醫(yī)大學學報;1998年04期

4 姚兵,黃威權,蒲若蕾,孫嵐,張榮慶,王雷;大鼠消化道促性腺激素釋放激素受體mRNA的原位雜交研究[J];解剖學報;2000年03期

5 姚兵,黃威權,張榮慶,王雷;大鼠頜下腺GnRH受體基因的體外擴增及基因序列分析[J];解剖學報;2001年01期

6 黃威權，向正華，孟琳;促性腺激素釋放激素mRNA陽性細胞在大鼠胃腸胰系統(tǒng)的分布[J];解剖學報;1996年02期

7 金花淑,黃威權,張金山,文永植,張崇理;大鼠頜下腺GnRH及其受體的免疫組織化學雙標記和年齡變化[J];解剖學報;1998年01期

8 金曉航,黃威權;促性腺激素釋放激素免疫調節(jié)作用的研究進展[J];生理科學進展;2000年02期

9 張金山,黃高升,黃威權,張遠強;促性腺激素釋放素及其受體在人肝癌組織中的分布及意義[J];中華醫(yī)學雜志;1998年05期

本文編號：2593037