【摘要】： 促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)是由下丘腦神經(jīng)元分泌的一種含有十個(gè)氨基酸的肽類激素，經(jīng)下丘腦-垂體-門脈系統(tǒng)進(jìn)入垂體前葉，作用于垂體前葉的促性腺激素分泌細(xì)胞，刺激卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)和黃體生成素(luteinizing hormone，LH)的分泌，從而調(diào)節(jié)性腺的發(fā)育與配子的形成。已有大量證據(jù)表明，GnRH及其受體可廣泛存在于下丘腦-垂體軸之外，如免疫系統(tǒng)(T、B淋巴細(xì)胞)、生殖系統(tǒng)(卵巢、輸卵管、前列腺、睪丸及胎盤等處)以及一些惡性腫瘤(乳腺癌、肺癌、胰腺癌及肝癌等)，對(duì)這些組織和器官及惡性腫瘤的生長起調(diào)控作用。 我們先前的研究表明，在大鼠的消化系統(tǒng)廣泛存在有GnRH及其受體，并且其受體的基因序列與垂體的基因序列一致，說明大鼠的消化系統(tǒng)能自身合成GnRH及其受體，同時(shí)這些組織或細(xì)胞是GnRH作用的靶細(xì)胞，如GnRH類似物可明顯促進(jìn)大鼠頜下腺對(duì)神經(jīng)生長因子的分泌。那么，在培養(yǎng)的大鼠胃平滑肌細(xì)胞、胃粘膜壁細(xì)胞是否存在有GnRH及其受體，其GnRH的基因序列怎樣?GnRH對(duì)它們的功能影響如何?均未見報(bào)道。因此我們 第囚軍匡大學(xué)謬玄學(xué)伍淪文 在先前研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了以下研究：D」首先對(duì)大鼠的胃平滑肌細(xì)胞 進(jìn)行了分離培養(yǎng)及鑒定，并采用免疫細(xì)胞化學(xué)、原位雜交技術(shù)在培養(yǎng)的平 滑肌細(xì)胞上原位檢測(cè)GnRH受體的表達(dá)；［2］運(yùn)用放射免疫分析法檢測(cè)了 GnRH類似物對(duì)大鼠胃平滑肌細(xì)胞PKC酶活性的影響，然后運(yùn)用激光共聚 焦技術(shù)檢測(cè)了GnRH類似物對(duì)胃平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca’”濃度的影響，以探討胃 平滑肌細(xì)胞內(nèi) GnRH受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制：［3］GnRH類似物對(duì)培養(yǎng)的 胃平滑肌細(xì)胞處理后，分別采用＊T比色法、’H－TdR摻入法、檢測(cè)PCNA 法和流式細(xì)胞儀技術(shù)觀察GnRH類似物對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖情況及細(xì)胞周期 分布的影響：「d對(duì)大鼠的胃壁細(xì)胞進(jìn)行了分離培養(yǎng)及鑒定，運(yùn)用形態(tài)學(xué) 研究的方法檢測(cè)了GnRH及其受體在培養(yǎng)的胃壁細(xì)胞上的分布，并運(yùn)用 RT－PCR、基因克隆測(cè)序等技術(shù)對(duì)壁細(xì)胞分泌的GnRH基因序列進(jìn)行了研究； ［5］ 用激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)GnRH類似物對(duì)培養(yǎng)的大鼠胃壁細(xì)胞內(nèi)Ca’”濃 度的影響，同時(shí)檢測(cè)了GnRH類似物對(duì)在體大鼠胃酸分泌的作用，進(jìn)一步 了解GnRH對(duì)消化系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)，為先前提出GnRH也是一種胃腸激素 的新觀點(diǎn)提供更直接的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 主要研究結(jié)果如下： 1．運(yùn)用免疫細(xì)胞化學(xué)和原位雜交的方法發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)的大鼠胃平滑肌 細(xì)胞含有GnRH受體免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)，同樣含有GnRH受體InRNA雜 交信號(hào)，二者均位于細(xì)胞漿內(nèi)，胞核為陰性，說明培養(yǎng)的胃平滑肌細(xì)胞能 表達(dá)GnRH受體，是Gs作用的靶細(xì)胞。 2．運(yùn)用放射性同位素的方法檢測(cè)了GnRH類似物（阿拉瑞林）對(duì)大鼠 胃平滑肌細(xì)胞PKC ＆活性的影響，發(fā)現(xiàn)阿拉瑞林可使培養(yǎng)的大鼠胃平滑肌 細(xì)胞中PKC活性明顯升高，3Inin時(shí)達(dá)高峰，10Inin后作用明顯降低，且 成劑量依賴性；同時(shí)發(fā)現(xiàn)在無外CaZ”時(shí)，，阿拉瑞林也可使PKC活性升高， ．5－ 第回軍皿大學(xué)傅士學(xué)伍論文 但不如有外鈣存在時(shí)高o＜0．05卜因此PKC活性的增高，并不完全依賴細(xì) 胞外C八 它可以動(dòng)員胞內(nèi)＊“的釋放激活PKC。 3．阿拉瑞林可使胞內(nèi)叨”濃度升高，說明＊”參與了GnRH類似 物阿拉瑞林對(duì)胃平滑肌細(xì)胞作用的細(xì)胞內(nèi)分子轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，而細(xì)胞內(nèi)＊擴(kuò) 的升高既源于細(xì)胞內(nèi)鈣的釋放又源于細(xì)胞外鈣的內(nèi)流，外鈣的內(nèi)流主要是 通過L－type鈣通道實(shí)現(xiàn)的，內(nèi)鈣的釋放不是通過RyRs受體，而是通過IP3 受體實(shí)現(xiàn)的。 4．細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn)表明，隨著阿拉瑞林濃度的增大，與未用藥的對(duì) 照組相比，發(fā)現(xiàn)其M17’吸光度K值）逐漸降低（＜0刀5）；P CNCNA表達(dá)的平 均熒光值逐漸減弱o＜0刀5）：大鼠胃平滑肌細(xì)胞的’付＊皿參入量依次減 少（P＜（、05卜 且藥物濃度越大，此三者下降越明顯。在細(xì)胞周期中，與對(duì) 照組相比，GI期細(xì)胞所占比例明顯增加（P＜．05h S期細(xì)胞所占比例明顯 減少，且隨藥物濃度的增加而逐漸減少o＜0刀5卜說明＊nRH類似物可明 顯抑制大鼠胃平滑肌細(xì)胞的增殖作用，其作用途徑可能是通過平滑肌細(xì)胞 自身GnRH受體的直接介導(dǎo)而實(shí)現(xiàn)的。 5．運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對(duì)大鼠的胃粘膜壁細(xì)胞進(jìn)行了分離與培養(yǎng)，然 后采用形態(tài)學(xué)的研究方法，研究了GnRH及其受體在大鼠胃粘膜壁細(xì)胞中 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)胃粘膜壁細(xì)胞中含有GnRH蛋白和GnRll－mRNA，H者均定位 于細(xì)胞漿內(nèi)，并且發(fā)現(xiàn)GnRH受體蛋白及其GnRH受體的IuRNA也定位于細(xì) 胞漿內(nèi)，這提示大鼠胃粘膜壁細(xì)胞可自身合成和分泌GnRH，在胃粘膜壁 細(xì)胞GDRH可能以自分泌的方式調(diào)節(jié)壁細(xì)胞的功能。 6．我們從培養(yǎng)的大鼠壁細(xì)胞中提取總RNA，應(yīng)用RT－PCR的方法擴(kuò) 增Gngu基因，并對(duì)產(chǎn)洲行純化回收，連接入pUC19 ＆體中擴(kuò)增，經(jīng)eR 和酶切鑒定后進(jìn)行序列分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃壁細(xì)胞中GnRH的基因序列與下 丘腦的完全一致。 ．6．
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2593037