【摘要】：γδT細胞能夠以主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)非限制性方式識別多種腫瘤相關(guān)抗原,有效的殺傷腫瘤細胞,并能分泌干擾素(interferon, IFN)-γ等細胞因子。因此,γδT細胞已成為當前惡性腫瘤免疫治療中一種很有前景的候選細胞。 γδT細胞表面除表達γ和δ鏈組成的T細胞受體(T cell receptor γδ, TCRγδ)外,還表達自然殺傷(natural killer, NK)細胞的重要功能受體NKG2D。這兩種受體分子在γδT細胞對腫瘤細胞的殺傷中發(fā)揮重要的作用。目前,大部分文獻報導(dǎo)傾向于γδT細胞活化為TCRγδ依賴性的,而NKG2D僅起共刺激作用。然而,為什么單獨的TCRγδ刺激即可活化γδT細胞,NKG2D的共刺激作用又是如何發(fā)揮的?只有進一步回答這些問題,才能澄清γδT細胞生物學(xué)效應(yīng)(主要為細胞毒效應(yīng))的分子機制,尤其是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。 鑒此,本研究主要針對以下三個科學(xué)問題展開：一是γδT細胞殺傷腫瘤細胞的主要效應(yīng)途徑是什么?二是TCRγδ和NKG2D在活化γδT細胞殺傷功能中的具體作用是什么?三是γδT細胞殺傷功能活化的調(diào)控機制是什么?本文分以下兩部分就上述三個科學(xué)問題進行研究。 第一部分工作旨在進一步澄清γδT細胞殺傷腫瘤細胞的相關(guān)機理。首先,我們比較了穿孔素-顆粒酶和Fas-FasL兩條途徑在γδ T細胞殺傷腫瘤細胞中的貢獻。我們選取了五種不同組織來源的腫瘤細胞作為γδT細胞殺傷途徑研究的靶細胞,包括Daudi(人Burkkit淋巴瘤細胞)、G401(人腎癌Wilms細胞)、NCI-H446(人小細胞肺癌細胞)、HR8348(人結(jié)直腸癌細胞)和MGC-803(人胃癌細胞)。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明,這五種不同組織來源的腫瘤細胞表面Fas受體呈現(xiàn)不同程度的表達：Daudi為5.14%、G401為7.24%、NCI-H556為44.10%、HR8348為69.40%以及MGC-803為82.30%。然后,對這五種Fas受體表達水平不同的腫瘤細胞進行穿孔素-顆粒酶途徑及Fas-FasL途徑的封閉實驗。結(jié)果表明,封閉穿孔素-顆粒酶途徑后,γδT細胞對這五種腫瘤細胞的殺傷能力均顯著降低,而封閉Fas-FasL途徑對γδT細胞殺傷能力無顯著影響。隨后的酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)結(jié)果顯示,穿孔素-顆粒酶途徑封閉的γδT細胞與靶細胞共孵育后分泌IFN-γ的能力亦顯著降低。而Fas-FasL途徑封閉后,γδT細胞分泌IFN-y的能力無顯著變化。以上結(jié)果表明γδT細胞殺傷腫瘤細胞的主要途徑為穿孔素-顆粒酶途徑。 隨后,利用激活抗體包被的P815靶細胞殺傷體系,探討了TCRγδ和NKG2D在活化γδT細胞殺傷功能中的作用,并分析了二者功能存在差異的原因。P815靶細胞殺傷實驗結(jié)果表明,單獨給予抗TCRγδ抗體刺激即可活化γδT細胞,殺傷抗體包被的P815靶細胞,并分泌IFN-γ;而單獨的抗NKG2D抗體刺激卻不能活化γδT細胞的殺傷功能,也不能引起IFN-γ的分泌。然而,抗NKG2D抗體可以增強抗TCRγδ抗體刺激所引起的γδT細胞的殺傷功能和分泌IFN-γ的能力。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明,抗TCRγδ抗體和抗NKG2D抗體均可引起γδT細胞的脫顆粒反應(yīng)；激光共聚焦檢測結(jié)果表明,單獨的抗TCRγδ抗體刺激即可引起γδT細胞裂解性顆粒的極化,單獨的抗NKG2D抗體刺激卻不能。盡管如此,抗NKG2D抗體可以在某種程度上增強抗TCRγδ抗體所引起的裂解性顆粒極化。結(jié)合殺傷實驗結(jié)果,提示引起γδT細胞裂解性顆粒極化能力的不同是TCRγδ和NKG2D在活化γδT細胞殺傷功能方面存在功能差異的主要原因。 第二部分研究工作旨在明確調(diào)控γδT細胞殺傷功能活化的相關(guān)信號通路。首先對γδT細胞殺傷功能相關(guān)的活化信號通路進行了研究,主要集中在Vavl信號通路、磷酸脂酶C-γ1(Phospholipase C-γ1, PLC-γ1)信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase, Erk)信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase, PI3K)信號通路等四條與αβ T細胞和NK細胞活化相關(guān)的信號通路。運用Western blot技術(shù),證實了單獨的抗TCRγδ抗體刺激即可顯著性活化Vav1信號通路、PLC-γ1信號通路以及Erk信號通路；而單獨給予抗NKG2D抗體刺激則無此作用；在聯(lián)合給予抗NKG2D抗體刺激時,這三條信號通路的活化顯著增強。PI3K信號通路在給予抗TCRγδ抗體刺激或抗NKG2D抗體刺激時均明顯活化,而聯(lián)合給予二者刺激時,PI3K信號通路活化亦未見增強。結(jié)合殺傷實驗結(jié)果,提示Vav1信號通路、PLC-γ1信號通路以及Erk信號通路與γδT細胞殺傷功能密切相關(guān)。利用siRNA技術(shù)敲低γδT細胞內(nèi)的Vav1分子表達時,發(fā)現(xiàn)γδT細胞對靶細胞的殺傷、IFN-γ分泌以及裂解性顆粒極化能力均顯著降低；同時,敲低Vavl亦可顯著抑制PLC-γ1信號通路以及Erk信號通路的活化。利用信號通路抑制劑抑制γδT細胞內(nèi)的PLC-γ1信號通路以及Erk信號通路時,發(fā)現(xiàn)抑制PLC-γ1信號通路可顯著抑制γδT細胞的殺傷、IFN-γ分泌以及裂解性顆粒極化,而抑制Erk信號通路對γδT細胞的殺傷功能及裂解性顆粒極化均無顯著影響,但抑制Erk信號通路可抑制γδT細胞IFN-γ的分泌。此外,抑制PLC-γ1信號通路可顯著抑制γδT細胞內(nèi)Erk信號通路的活化。上述結(jié)果提示,Vav1-PLC-γ1信號通路位于Erk信號通路上游,并在γδT細胞殺傷功能活化中具有重要的作用。 隨后的研究工作證實了Cbl-b在γδT細胞殺傷功能活化中的負調(diào)控作用。利用siRNA技術(shù)敲低γδT細胞內(nèi)Cbl-b分子表達時,γδT細胞對靶細胞的殺傷能力、殺傷功能相關(guān)的Vav1-PLC-γ1信號通路活化以及裂解性顆粒極化均顯著提高；特別值得一提的是,單獨的抗NKG2D抗體刺激即可活化與γδT細胞的殺傷功能相關(guān)的Vav1-PLC-γ1信號通路,并引起裂解性顆粒極化,提示Cbl-b是單獨使用抗NKG2D抗體不能活化γδT細胞殺傷功能的主要負調(diào)控因素,亦提示γδT細胞殺傷功能活化需要一個較強的活化信號來克服活化抑制信號；Vav1過表達實驗進一步證實了這一點。此外,RNAi實驗也證實了Cbl-b是通過抑制Vavl磷酸化而發(fā)揮其負調(diào)控功能的。 綜上所述,本研究得出以下主要結(jié)論：1、γδT細胞殺傷靶細胞主要通過穿孔素-顆粒酶途徑；2、γδT細胞殺傷功能為TCRγδ依賴性的,NKG2D可增強TCRγδ依賴性的γδT細胞殺傷功能；3、引起裂解性顆粒極化能力的不同是TCRγδ和NKG2D在活化γδT細胞殺傷功能方面存在差別的原因；4、Vav1-PLC-γ1信號通路與γδT細胞殺傷功能密切相關(guān)；5、Cbl-b負調(diào)控γδT細胞殺傷功能；6、γδT細胞殺傷功能的活化需要一個較強的活化信號來克服活化抑制信號,最終使γδT細胞發(fā)揮殺傷能力。本研究深入揭示了TCR依賴性γδT細胞殺傷活性的分子機制,發(fā)現(xiàn)γδT細胞殺傷功能的實現(xiàn)需要經(jīng)Vav1-PLC-γ1信號通路的活化來消除E3泛素連接酶Cbl-b的抑制作用,為深入闡明γδT細胞生物學(xué)效應(yīng)的作用機制提供了研究資料。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392

【共引文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 賀偉鋒;程文廣;胡婕;羅高興;陳希煒;尹芝南;吳軍;;激活后γδT細胞迅速增殖分子機制的初步研究[J];重慶醫(yī)學(xué);2006年24期

2 黃小娟;齊文慧;王俊艷;;誘導(dǎo)共刺激分子對Th17細胞發(fā)展的作用[J];解剖學(xué)研究;2013年04期

3 任敏敏;顧健;;間充質(zhì)干細胞對系統(tǒng)性紅斑狼瘡免疫性血栓形成的調(diào)控[J];中國組織工程研究;2013年45期

4 張麗娜;楊晶;張峰波;丁劍冰;;濾泡輔助性T細胞與寄生蟲感染的關(guān)系[J];中國病原生物學(xué)雜志;2013年07期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 代玉梅;人類γδT細胞對內(nèi)源性配體分子人MutS同源蛋白2的識別機制及相關(guān)天然免疫監(jiān)視作用研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2011年

2 姜燕;腫瘤浸潤性γδ1T細胞（γδ1TIL）CDR3δ1區(qū)的序列分析及TCRγδ1　CDR3δ1結(jié)合腫瘤抗原的分子結(jié)構(gòu)研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2010年

3 劉新建;攜帶mda-7/IL24的嵌合型溶瘤腺病毒對wnt信號異常腫瘤的靶向基因—病毒治療[D];上海交通大學(xué);2011年

4 宋英暉;白細胞介素15在抗腫瘤免疫機制中的作用[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2002年

5 任鵬康;腫瘤靶向性腺病毒載體的構(gòu)建及其在腫瘤基因治療中的應(yīng)用[D];復(fù)旦大學(xué);2006年

6 許春萍;γδT細胞抗原識別機制：TCRδ_2-CDR3的抗原結(jié)合特異性與TCRδ_2-CDR3合成肽釣取抗原表位的新策略[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2006年

7 郗雪艷;T細胞受體δ2鏈互補決定區(qū)（CDR）3與抗原結(jié)合的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2008年

8 陳慧;采用基于CDR3δ肽結(jié)合特性的免疫—生物化學(xué)技術(shù)策略鑒定TCRγδ所識別的新型配體-hMSH2蛋白[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2008年

9 黃慧聰;廣州管圓線蟲感染免疫中ICOS-ICOSL通路及發(fā)育期蛋白的分析和研究[D];蘇州大學(xué);2013年

10 唐宗生;CD28家族受體對慢性HBV感染的影響及其機制的研究[D];華中科技大學(xué);2013年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前9條

1 劉楠;苦參素對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠的防治作用及免疫機制的探討[D];鄭州大學(xué);2013年

2 陳輝;腎小管上皮細胞中HIF-1α對MICA調(diào)控作用的研究[D];鄭州大學(xué);2013年

3 蒿姍姍;硼替佐米提高多發(fā)性骨髓瘤U266細胞對γ δ T細胞殺傷敏感性的研究[D];吉林大學(xué);2013年

4 薛永;鉛對非興奮性細胞毒性機制的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2012年

5 田愛;滇重樓提取物CV抑制云南宣威肺腺癌細胞株XWLC-05的實驗研究[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2013年

6 李堯;T細胞活化中NF-κB通過特異性結(jié)合Cbl-b啟動子序列負向調(diào)控Cbl-b表達[D];華中科技大學(xué);2012年

7 趙彬;c-Abl激酶與Vav1在調(diào)節(jié)中性粒細胞遷移運動中的作用研究[D];東北師范大學(xué);2013年

8 杜發(fā)旺;丙戊酸鈉在γδT細胞對肺癌A549細胞免疫中的作用[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2013年

9 藺志杰;pCD86：RAE-1ε轉(zhuǎn)基因小鼠CD4~+NKG2D~+T細胞的生物學(xué)特性研究[D];揚州大學(xué);2013年

，

本文編號：2593565