【摘要】：γδT細胞能夠以主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex, MHC)非限制性方式識別多種腫瘤相關抗原,有效的殺傷腫瘤細胞,并能分泌干擾素(interferon, IFN)-γ等細胞因子。因此,γδT細胞已成為當前惡性腫瘤免疫治療中一種很有前景的候選細胞。 γδT細胞表面除表達γ和δ鏈組成的T細胞受體(T cell receptor γδ, TCRγδ)外,還表達自然殺傷(natural killer, NK)細胞的重要功能受體NKG2D。這兩種受體分子在γδT細胞對腫瘤細胞的殺傷中發(fā)揮重要的作用。目前,大部分文獻報導傾向于γδT細胞活化為TCRγδ依賴性的,而NKG2D僅起共刺激作用。然而,為什么單獨的TCRγδ刺激即可活化γδT細胞,NKG2D的共刺激作用又是如何發(fā)揮的?只有進一步回答這些問題,才能澄清γδT細胞生物學效應(主要為細胞毒效應)的分子機制,尤其是信號轉導機制。 鑒此,本研究主要針對以下三個科學問題展開：一是γδT細胞殺傷腫瘤細胞的主要效應途徑是什么?二是TCRγδ和NKG2D在活化γδT細胞殺傷功能中的具體作用是什么?三是γδT細胞殺傷功能活化的調控機制是什么?本文分以下兩部分就上述三個科學問題進行研究。 第一部分工作旨在進一步澄清γδT細胞殺傷腫瘤細胞的相關機理。首先,我們比較了穿孔素-顆粒酶和Fas-FasL兩條途徑在γδ T細胞殺傷腫瘤細胞中的貢獻。我們選取了五種不同組織來源的腫瘤細胞作為γδT細胞殺傷途徑研究的靶細胞,包括Daudi(人Burkkit淋巴瘤細胞)、G401(人腎癌Wilms細胞)、NCI-H446(人小細胞肺癌細胞)、HR8348(人結直腸癌細胞)和MGC-803(人胃癌細胞)。流式細胞術檢測結果表明,這五種不同組織來源的腫瘤細胞表面Fas受體呈現(xiàn)不同程度的表達：Daudi為5.14%、G401為7.24%、NCI-H556為44.10%、HR8348為69.40%以及MGC-803為82.30%。然后,對這五種Fas受體表達水平不同的腫瘤細胞進行穿孔素-顆粒酶途徑及Fas-FasL途徑的封閉實驗。結果表明,封閉穿孔素-顆粒酶途徑后,γδT細胞對這五種腫瘤細胞的殺傷能力均顯著降低,而封閉Fas-FasL途徑對γδT細胞殺傷能力無顯著影響。隨后的酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)結果顯示,穿孔素-顆粒酶途徑封閉的γδT細胞與靶細胞共孵育后分泌IFN-γ的能力亦顯著降低。而Fas-FasL途徑封閉后,γδT細胞分泌IFN-y的能力無顯著變化。以上結果表明γδT細胞殺傷腫瘤細胞的主要途徑為穿孔素-顆粒酶途徑。 隨后,利用激活抗體包被的P815靶細胞殺傷體系,探討了TCRγδ和NKG2D在活化γδT細胞殺傷功能中的作用,并分析了二者功能存在差異的原因。P815靶細胞殺傷實驗結果表明,單獨給予抗TCRγδ抗體刺激即可活化γδT細胞,殺傷抗體包被的P815靶細胞,并分泌IFN-γ;而單獨的抗NKG2D抗體刺激卻不能活化γδT細胞的殺傷功能,也不能引起IFN-γ的分泌。然而,抗NKG2D抗體可以增強抗TCRγδ抗體刺激所引起的γδT細胞的殺傷功能和分泌IFN-γ的能力。流式細胞術檢測結果表明,抗TCRγδ抗體和抗NKG2D抗體均可引起γδT細胞的脫顆粒反應；激光共聚焦檢測結果表明,單獨的抗TCRγδ抗體刺激即可引起γδT細胞裂解性顆粒的極化,單獨的抗NKG2D抗體刺激卻不能。盡管如此,抗NKG2D抗體可以在某種程度上增強抗TCRγδ抗體所引起的裂解性顆粒極化。結合殺傷實驗結果,提示引起γδT細胞裂解性顆粒極化能力的不同是TCRγδ和NKG2D在活化γδT細胞殺傷功能方面存在功能差異的主要原因。 第二部分研究工作旨在明確調控γδT細胞殺傷功能活化的相關信號通路。首先對γδT細胞殺傷功能相關的活化信號通路進行了研究,主要集中在Vavl信號通路、磷酸脂酶C-γ1(Phospholipase C-γ1, PLC-γ1)信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)/細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase, Erk)信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase, PI3K)信號通路等四條與αβ T細胞和NK細胞活化相關的信號通路。運用Western blot技術,證實了單獨的抗TCRγδ抗體刺激即可顯著性活化Vav1信號通路、PLC-γ1信號通路以及Erk信號通路；而單獨給予抗NKG2D抗體刺激則無此作用；在聯(lián)合給予抗NKG2D抗體刺激時,這三條信號通路的活化顯著增強。PI3K信號通路在給予抗TCRγδ抗體刺激或抗NKG2D抗體刺激時均明顯活化,而聯(lián)合給予二者刺激時,PI3K信號通路活化亦未見增強。結合殺傷實驗結果,提示Vav1信號通路、PLC-γ1信號通路以及Erk信號通路與γδT細胞殺傷功能密切相關。利用siRNA技術敲低γδT細胞內的Vav1分子表達時,發(fā)現(xiàn)γδT細胞對靶細胞的殺傷、IFN-γ分泌以及裂解性顆粒極化能力均顯著降低；同時,敲低Vavl亦可顯著抑制PLC-γ1信號通路以及Erk信號通路的活化。利用信號通路抑制劑抑制γδT細胞內的PLC-γ1信號通路以及Erk信號通路時,發(fā)現(xiàn)抑制PLC-γ1信號通路可顯著抑制γδT細胞的殺傷、IFN-γ分泌以及裂解性顆粒極化,而抑制Erk信號通路對γδT細胞的殺傷功能及裂解性顆粒極化均無顯著影響,但抑制Erk信號通路可抑制γδT細胞IFN-γ的分泌。此外,抑制PLC-γ1信號通路可顯著抑制γδT細胞內Erk信號通路的活化。上述結果提示,Vav1-PLC-γ1信號通路位于Erk信號通路上游,并在γδT細胞殺傷功能活化中具有重要的作用。 隨后的研究工作證實了Cbl-b在γδT細胞殺傷功能活化中的負調控作用。利用siRNA技術敲低γδT細胞內Cbl-b分子表達時,γδT細胞對靶細胞的殺傷能力、殺傷功能相關的Vav1-PLC-γ1信號通路活化以及裂解性顆粒極化均顯著提高；特別值得一提的是,單獨的抗NKG2D抗體刺激即可活化與γδT細胞的殺傷功能相關的Vav1-PLC-γ1信號通路,并引起裂解性顆粒極化,提示Cbl-b是單獨使用抗NKG2D抗體不能活化γδT細胞殺傷功能的主要負調控因素,亦提示γδT細胞殺傷功能活化需要一個較強的活化信號來克服活化抑制信號；Vav1過表達實驗進一步證實了這一點。此外,RNAi實驗也證實了Cbl-b是通過抑制Vavl磷酸化而發(fā)揮其負調控功能的。 綜上所述,本研究得出以下主要結論：1、γδT細胞殺傷靶細胞主要通過穿孔素-顆粒酶途徑；2、γδT細胞殺傷功能為TCRγδ依賴性的,NKG2D可增強TCRγδ依賴性的γδT細胞殺傷功能；3、引起裂解性顆粒極化能力的不同是TCRγδ和NKG2D在活化γδT細胞殺傷功能方面存在差別的原因；4、Vav1-PLC-γ1信號通路與γδT細胞殺傷功能密切相關；5、Cbl-b負調控γδT細胞殺傷功能；6、γδT細胞殺傷功能的活化需要一個較強的活化信號來克服活化抑制信號,最終使γδT細胞發(fā)揮殺傷能力。本研究深入揭示了TCR依賴性γδT細胞殺傷活性的分子機制,發(fā)現(xiàn)γδT細胞殺傷功能的實現(xiàn)需要經(jīng)Vav1-PLC-γ1信號通路的活化來消除E3泛素連接酶Cbl-b的抑制作用,為深入闡明γδT細胞生物學效應的作用機制提供了研究資料。
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R392

【共引文獻】

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本文編號：2593565