【摘要】： 神經(jīng)營養(yǎng)因子是指機體產(chǎn)生的能夠促進(jìn)中樞和外周神經(jīng)細(xì)胞存活、生長和分化的多肽生長因子。神經(jīng)營養(yǎng)因子既可以影響發(fā)育早期胚胎神經(jīng)元或者前體細(xì)胞的生長與分化，還能夠促進(jìn)成熟神經(jīng)細(xì)胞的存活與生長，而且它對于治療一些神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病或促進(jìn)神經(jīng)損傷后修復(fù)具有非常重要的作用。 神經(jīng)營養(yǎng)因子結(jié)合并作用于神經(jīng)營養(yǎng)因子受體，激活胞內(nèi)信號通路后，才能發(fā)揮其重要的生物學(xué)效應(yīng)。神經(jīng)營養(yǎng)因子以其化學(xué)組成和受體的特性等可以分為多個家族，如GDNF家族、NGF家族等。GDNF、NGF、EGF的生物學(xué)效應(yīng)分別由GDNF受體RET、NGF受體TrkA及EGF受體EGFR所介導(dǎo)。盡管上述配體不盡相同，但它們的受體均屬于受體酪氨酸激酶(RTK)。近幾年來，為了更多地理解為何不同的配體、受體可引起類似或特定的生物學(xué)效應(yīng)，人們對于細(xì)胞內(nèi)由這些受體介導(dǎo)多種信號通路的研究越來越重視。大量工作表明，配體與受體結(jié)合，引起受體的二聚化并同時激活受體后，受體可結(jié)合大量的信號蛋白分子，如接頭蛋白、入塢蛋白或各種調(diào)節(jié)蛋白等。正是由于大量不同信號分子不斷整合的結(jié)果，多種不同的信號得以正確傳遞。發(fā)現(xiàn)并了解這些參與受體下游通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號分對于人們更好地理解胞內(nèi)信號通路無疑具有重要的意義。 因此，本研究應(yīng)用酵母雙雜交篩選文庫的方法，尋找胞漿內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子受體酪氨酸激酶的可能底物或調(diào)控蛋白，為進(jìn)一步探索受體下游的具體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或調(diào)節(jié)機制打下基礎(chǔ)。 本研究的主要結(jié)果如下： 1、將RET胞內(nèi)域與LexA蛋白融合構(gòu)建成pGilda-RET~(IC)，確認(rèn)無自激活作用后，將其作 第H軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 口摘要（中英文） 為誘餌蛋白，經(jīng)酵母雙雜交方法篩選人腦LexA cDNA文庫，獲得274個克隆。經(jīng)p－半乳糖 苦酶活性鑒定和測序分析進(jìn)一步鑒別，篩選到21個質(zhì)粒片段，從中獲得并明確為SHZE等 基因片段。將pGilda－RET廠與pB42ADS 書共轉(zhuǎn)化HLYSIg，共轉(zhuǎn)化子的 p－半乳糖昔酶活 力檢測呈陽性，表明在酵母中S＊2丑與RE丫”之間可相互作用。在獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染M T與＊F＊。 質(zhì)粒的PC 12細(xì)胞基礎(chǔ)上，再瞬時轉(zhuǎn)染野生型SHZE或者其突變體R555E于此穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞 株中。細(xì)胞裂解物的免疫共沉淀實驗結(jié)果顯示，僅當(dāng) GDNF刺激轉(zhuǎn)染了野生型SHZ－B的 PC 細(xì)胞時，，可以檢測到RET與SHZE的結(jié)合。此結(jié)果表明，GDNF刺激過量表達(dá)RET、GFRa 與 SHZ－B的PC細(xì)胞后，SHZ－B可與 MT在體內(nèi)發(fā)生結(jié)合。細(xì)胞的形態(tài)觀察顯示，GDNF 作用于僅轉(zhuǎn)染RET與 GFRa質(zhì)粒的PC細(xì)胞或轉(zhuǎn)染MT、GFRa與 SHZ8質(zhì)粒的PC細(xì)胞后， 細(xì)胞的分化均較明顯；而作用于轉(zhuǎn)染RET、GFRa與SHZE突變體R555E質(zhì)粒的PC12細(xì)胞后， 分化程度明顯降低，具有統(tǒng)計學(xué)意義。上述結(jié)果表明，MT與SHZE的結(jié)合可能參與GDNF 刺激引起PC細(xì)胞分化的信號通路。 2、將EGFR胞內(nèi)域與LexA蛋白融合構(gòu)建成pGilda七GFR＼確認(rèn)無自激活作用后， 將其作為誘餌蛋白，經(jīng)酵母雙雜交方法篩選人腦 LexA cDNA文庫，獲得 112個克隆。經(jīng) p－半乳糖昔酶活性鑒定和測序分析進(jìn)一步鑒別，篩選到6個質(zhì)粒片段，從中獲得并明確為 doki等基因片段。將 pGilda－EGFR’C與 pB42AD－doki共轉(zhuǎn)化 HLY819，共轉(zhuǎn)化子的p－半乳 糖昔酶活力測定呈陽性，表明在酵母中 doki與 EGFR‘C可結(jié)合。pGildUEGFR’C與 pB42AD刁ok1PTB酵母共轉(zhuǎn)化子的p－半乳糖昔酶活力以及 SD Gal Ura“His”Tp’Leu”平板生 長實驗均呈陽性，表明 doki可經(jīng) PTB結(jié)構(gòu)域與 EGFR’C結(jié)合。缺失 PTB結(jié)構(gòu)域的 doki門 doki A PTB）與EGFR‘’共轉(zhuǎn)化子的p－半乳糖昔酶活力以及SD Ga1Ura”His’切“Leu平板生 長實驗均呈陰性，從而進(jìn)一步從反面證實doki可經(jīng)PTB結(jié)構(gòu)域與EGFR‘“結(jié)合。兔疫共沉 3 — — 淀的實驗結(jié)果，進(jìn)一步證實了在酵母中d。hi可經(jīng)PTB結(jié)構(gòu)域與EGFRIC相互作用。根據(jù) doki PTB結(jié)構(gòu)域與來自EGFR小肽的立體結(jié)構(gòu)模擬提示，我們選擇了d。k1PTB結(jié)構(gòu)域內(nèi)的 八個氨基酸殘基進(jìn)行突變，即73Y、74T、76L、77R、79Y、92R、93R與119I，每個氨基 酸殘基均突變?yōu)楸彼?Ala，再將這些 dok1PTB突變體與 EGFR’“共轉(zhuǎn)化酵母 HLY819，檢 測共轉(zhuǎn)化子的－半乳糖昔酶活力。結(jié)果顯示，當(dāng)PTB結(jié)構(gòu)域內(nèi)的73Y、76L、77R或92R 突變?yōu)榇╝后，EGFR’”不能與 doklPTB結(jié)合；而 74T。79Y、93R與 119I突變?yōu)?Ala后， EGFR廠仍可與 d。klPTB結(jié)合。上述結(jié)果表明，d。k1PTB結(jié)構(gòu)域內(nèi)的 73Y、76L、77R和 92R殘基在EGFR與doki的結(jié)合中具有重要作用。 3、將TrkA胞內(nèi)域與LexA蛋白融合構(gòu)建成pGilda－Ti＊，確認(rèn)無自激活作用后，將其
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號】：Q516

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2592733