【摘要】： 血栓性疾病的發(fā)生是由多種遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。vWF是由血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞合成的多聚體糖蛋白，既可在高切狀態(tài)下啟動(dòng)血小板粘附、聚集，又是攜帶凝血因子Ⅷ的載體，最近的許多體外實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示，vWF在血栓形成中起著關(guān)鍵性作用。研究表明，vWF是一般人群中經(jīng)常發(fā)生的心肌梗死的危險(xiǎn)因素，vWF基因啟動(dòng)子區(qū)域的-1051G／A、-1792C／G等多態(tài)性可通過(guò)調(diào)節(jié)血漿vWF水平而與缺血性心臟病的發(fā)生密切相關(guān)，vWF多肽序列中Thr789Ala多態(tài)性也是Ⅰ型糖尿病病人中冠心病發(fā)生的一個(gè)危險(xiǎn)因素。因而有理由將其作為血栓形成的候選因子進(jìn)行研究�；蛐酒夹g(shù)已在基因測(cè)序，基因突變及多態(tài)性分析，基因表達(dá)及功能分析，文庫(kù)篩查，新藥開發(fā)以及病原體檢測(cè)等方面進(jìn)行了應(yīng)用和探討，呈現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)是遺傳變異中最常見(jiàn)的一種變異方式，在人類基因組中其發(fā)生頻率為每1000bp中0.5-10個(gè)。由于多基因與環(huán)境間具有十分復(fù)雜的相互作用，必須對(duì)人群中大量出現(xiàn)的SNP進(jìn)行確定，才能對(duì)它們?cè)诩膊“l(fā)生發(fā)展中的作用進(jìn)行解釋。本研究擬探討vWF基因RsaⅠ、SmaⅠ多態(tài)性與血栓性疾病的發(fā)生有無(wú)相關(guān)關(guān)系；并對(duì)基因芯片技術(shù)在SNP檢測(cè)上的應(yīng)用進(jìn)行探討。 研究中，我們首先建立vWF基因RsaⅠ、SmaⅠ多態(tài)性寡核苷酸陣列檢測(cè)方法。設(shè)計(jì)、合成兩組寡核苷酸探針，使用3甲氧基氨基丙基硅烷、戊二醛等化學(xué)物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)探針與固相支持物玻片的連接。應(yīng)用不對(duì)稱PCR方法擴(kuò)增RsaⅠ、SmaⅠ多態(tài)性片段，在擴(kuò)增體系中摻入熒光標(biāo)記dUTP，獲得被測(cè)片段的單鏈標(biāo)記產(chǎn)物。對(duì)核酸雜交反應(yīng)的溫度、動(dòng)力學(xué)和離子濃度變化進(jìn)行研究，獲得最佳的雜交鑒別條件，隨機(jī)抽取20名正常人，酶切法確定多態(tài)性基因型，再用寡核苷酸陣列法檢測(cè)，以驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性。使用該方法對(duì)50例血栓病人進(jìn)行檢測(cè)，，探討血栓性疾病的發(fā)生與vWF基因RsaⅠ、SmaⅠ多態(tài)性的關(guān)系。結(jié)果表明，寡核苷酸陣列法和酶切法對(duì)20例標(biāo)本檢測(cè)的符合率為100％；血栓病人與正常人之間兩位 蘇州大學(xué)傅士學(xué)位論文 中文摘要 點(diǎn)多態(tài)性的基因型和等位基因頻率的差異均無(wú)顯著意義（P＞0．05）。因而本研究 成功建立 vWF基因 Rsa、Sma多態(tài)性寡核苦酸陣列檢測(cè)方法，為基因芯片技 術(shù)在SNP檢測(cè)上的應(yīng)用提供依據(jù)；同時(shí)也對(duì)遺傳性疾病的高效診斷途徑進(jìn)行了成 功探索；未獲明確證據(jù)表明Rsa、Sma多態(tài)性與血栓的發(fā)生有關(guān)。 上述研究中，雖然50例血栓病人與正常人之間Sma多態(tài)性在基因頻率與 基因型分布的差異上無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，然而 Sma陽(yáng)性純合子在血栓病人中的 出現(xiàn)頻率為正常人的2．7倍。為弄清這一多態(tài)性對(duì)血栓發(fā)生的確切影響，我們擴(kuò) 大樣本例數(shù)，并使用價(jià)格低廉的聚合酶鏈反應(yīng)－限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析 （PCR－RFLP）技術(shù)代替寡核苦酸陣列檢測(cè)方法，對(duì)107例急性腦梗死（腦梗）、 49例急性心肌梗死（心梗）病人和 113例正常對(duì)照，檢測(cè) vWF基因 Sma多態(tài) 性，并對(duì)其中來(lái)自同一醫(yī)院的53例腦梗、22例心梗病人和47例正常對(duì)照進(jìn)行 血漿 vWFkg測(cè)定。結(jié)果，vAF基因 Sma多態(tài)位點(diǎn)各基因型和等位基因分布， 在腦梗病人與正常對(duì)照組間差異有顯著意義①．OD戶0．om；O．05＞戶0．02人其 中 S。al陽(yáng)性純合子（CC）使患腦梗的危險(xiǎn)度提高了 3．29倍（0R＝＝3．29 95％CI： ，1．5個(gè)7．01，0．m壩0．001人心梗病人與正常對(duì)照組間各基因型和等位基因分布 差異無(wú)顯著意義（0．50＞p）0．30；0．30＞p＞0．20）。血漿 vWFhg測(cè)定結(jié)果為，正常 人及腦梗、心梗病人血漿 VWFkg水平分別為 0．468、0．584和 0．783U砌l。腦梗 病人與正常對(duì)照間無(wú)顯著性差異（peo．195人而心梗病人與正常對(duì)照間有顯著性 差異（p＝0．00人 v呷基因 Sma多態(tài)位點(diǎn)各基因型分布在腦梗、心梗病人和正 常人各組中與血漿VWF Ag水平均無(wú)相互關(guān)系（P＝0．323，P＝0．315，peo．96人表 明，vWF基因Sma多態(tài)性與腦梗發(fā)病相關(guān)，可能是腦梗發(fā)病的危險(xiǎn)因素之一； 未發(fā)現(xiàn)與急性心肌梗死發(fā)病相關(guān)；該多態(tài)位點(diǎn)與血漿 vWFkg水平無(wú)關(guān)。 血小板在血栓形成尤其是動(dòng)脈血栓形成中起著十分重要的作用，選擇適當(dāng) 抗體、蛇毒、合成肽等物質(zhì)，有效抑制血小板的功能，己成為研制新型抗血栓藥 物的有效途徑。其中以抗 GP 11b／Illa單克隆抗體 7E3為親本制備的人－鼠嵌合抗 體hab片段C7E3，能顯著降低急性冠脈綜合癥PTCA術(shù)后再梗塞和缺血并發(fā)癥的 。發(fā)生率，已獲FDA批準(zhǔn)，廣泛應(yīng)用于缺血性心臟病患者的治療。SZ《是我室制 備的一株針對(duì) GPIb a的單克隆抗體，其抗原表位位于 GPIb a Try276－Gin282，不 僅具有抑制瑞斯托霉素、博托?
【圖文】：

由圖1、2可見(jiàn)，Rsal、Sma工均由三條帶組成(最前面模糊條果各組探針序列見(jiàn)表1。表中Rsal陰性序列，因此如果標(biāo)記單a工陽(yáng)性純合子;如果標(biāo)記單鏈性純合子;如果可同時(shí)與RPI、R中SPI用于檢測(cè)Sma工陰性序別檢測(cè)出Smal陽(yáng)性純合子、陰性條件研究中的對(duì)照，同時(shí)也對(duì)4在未知序列測(cè)定中的應(yīng)用提供依

ma工片段熒光標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳標(biāo)記片段.4.DNAMarker:100bpLadder.5.Sma:)3一N二CH一(CHZ)3一CH二N一(CHZ)。一O一P一O一TTTTTTTTTTTTTTTG圖3寡核昔酸探針與玻璃支持物表面的連接力學(xué)研究結(jié)果:雜交信號(hào)隨雜交反應(yīng)時(shí)間的延大(1461bp)，與探針結(jié)合后所產(chǎn)生的空間位阻也而Smal片段隨時(shí)間的增長(zhǎng)強(qiáng)度低于RSal片段(3
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號(hào)】：R346

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 安廣宇,董寧征,阮長(zhǎng)耿;抗血小板膜糖蛋白單克隆抗體SZ-21基因克隆及單鏈抗體的構(gòu)建和表達(dá)[J];免疫學(xué)雜志;2001年03期

2 劉曉健,安廣宇,董寧征,邵波靜,阮長(zhǎng)耿;抗人血小板膜糖蛋白Ⅲa單克隆抗體抑制兔血栓形成的實(shí)驗(yàn)研究[J];江蘇醫(yī)藥;2001年04期

3 阮長(zhǎng)耿,盛茗;基因多態(tài)性研究與血液病[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2000年09期

本文編號(hào)：2592296