【摘要】：葡萄球菌腸毒素（Staphyloccucal enterotoxins,SEs）是由葡萄球菌分泌的細菌外毒素，目前已報道的有SEA、SEB、SEC1-3、SED、SEE、SEF、SEG等二十多種血清型，共稱為葡萄球菌SE類超抗原，是細菌性食物中毒、化膿性感染、院內感染的重要毒素。 作為一類超抗原，通過橋聯(lián)結合抗原提呈細胞上的MHC II類分子和TCR的β鏈V區(qū)，形成MHC II類分子:SEs:TCR的三元復合物，直接激活T淋巴細胞，并導致一系列炎癥細胞因子的釋放，從而引起高熱、惡心、腹瀉及毒素休克綜合征（TSS）。由金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)引起的TSS的病死率可達50%，與流感并發(fā)的SEB感染的死亡率更高達90%以上，因此SEB被美國特殊作戰(zhàn)處列為常規(guī)儲存的"標準"（"經典"）生物戰(zhàn)劑。 目前臨床上尚無針對SEB中毒的有效疫苗和藥物，而治療性單克隆抗體因其具有高特異性和低毒副作用的特性，常在SEB的防治過程中被列為首選方案。國內外的多個研究小組也獲得了一些鼠源抗SEB的中和性單克隆抗體，但只能達到部分的中和保護效果（63%），其對SEB誘導的T淋巴細胞激活的抑制作用也僅為50-75%；說明單一的單克隆抗體并非是超抗原家族致病過程最理想的抑制劑。而多種中和性抗體的聯(lián)合應用，雖可實現(xiàn)理想的協(xié)同作用，但由于其成分相對復雜、在藥效學評價方面需多次進行臨床實驗等因素，限制了推廣和應用。此外，由于多數中和性抗體的結合表位不明確，抗體的中和保護機制尚不明了，使研究難以有突破性進展，因此篩選中和保護性抗體、確定其結合表位，明確其中和保護的作用機制對于研制SEB的治療性抗體具有十分重要的意義。 本項研究旨在利用本實驗室已獲得的具有中和保護作用抗SEB的單克隆抗體的前提下，進一步通過鼠源3E2與SEB的共結晶，解析了SEB與中和保護抗體的作用界面，明確了SEB與鼠源3E2抗體結合表位的關鍵位點，初步闡明其中和保護作用的機制；進一步采用基因工程方法構建高效的雙可變區(qū)（DVD）可同時中和SEB MHC和TCR結合位點的中和性抗體3E2-4A3，研究主要包括三個部分： 一、抗SEB中和保護性抗體的作用及其結構基礎 在前期的研究中，我們通過大腸桿菌原核表達系統(tǒng)融合表達了GST-SEB蛋白，免疫Balb/C小鼠后，采用雜交瘤技術制備了10株具有中和保護作用的鼠源性單克隆抗體，并采用噬菌體12肽庫表位淘選了其中具有較高結合力的四株抗體，初步確定了m4A3、m3C1結合于SEB的TCR功能域，m3E2抗體結合于SEB的MHC II類分子功能域，m1A5結合于MHC II類分子功能域的附近。m3E2抗體的親和力略高于其它三株。 為了進一步確定m3E2抗體的中和保護作用的中和表位，我們將m3E2抗體與SEB做了共結晶，通過解析發(fā)現(xiàn)m3E2抗體主要結合于SEB MHC II類分子的結合功能域44FLYF47和71KDLADK76。我們將這幾處位置的氨基酸做了定點突變并在大腸桿菌原核表達系統(tǒng)中表達了突變體蛋白，通過ELISA、Western blot、3H增殖實驗及體外抑制細胞因子釋放實驗，證實SEB46Y和71K為m3E2與其結合的關鍵氨基酸。進一步我們分別將46Y突變成E/F/L/M，將71K突變成N/Q/R，通過Biacore測定其親和力，結果發(fā)現(xiàn)當46Y突變成E（谷氨酸）、Q（谷氨酰胺）時，SEB與m3E2不結合；當突變成F（苯丙氨酸）、M（甲硫氨酸）和R(精氨酸)時，親和力基本無變化，提示局部維持疏水環(huán)境對維護m3E2與SEB的緊密結合具有重要作用；而當71K突變成L（亮氨酸）、N（天冬氨酸）時，親和力分別由原來的5.7E-10下降至3.14E-8和1.41E-6。46Y的突變結果提示局部維持疏水環(huán)境對維護m3E2與SEB的緊密結合具有重要作用，71K的突變結果說明局部正電荷環(huán)境對抗原抗體間的親和力變化具有重要的意義。 二、抗SEB中和保護性抗體的協(xié)同作用 為了探討鼠源抗SEB中和保護性抗體的協(xié)同作用，我們將m3E2與其他三株中和保護性抗體進行了組合分組，通過3H增殖實驗和體外抑制細胞因子釋放實驗發(fā)現(xiàn)，m3E2+m4A3聯(lián)合應用對T細胞增殖的抑制作用達到73%，m3E2+m3C1的抑制效率為68%，而單用這三株抗體的抑制率平均在60%左右；m3E2+m4A3聯(lián)合應用對細胞因子IL-2、INF-γ、TNF-α釋放的抑制作用分別達到67.4%、68.8%和69%，m3E2+m3C1組的抑制效率為59.7%、64%、61.4%，而它們單用的抑制率平均僅有40%左右，表明m3E2+m4A3和m3E2+m3C1這兩組針對SEB不同功能域的抗體聯(lián)合應用具有協(xié)同作用，且m3E2+m4A3聯(lián)合應用的效果明顯優(yōu)于m3E2+m3C1。而其它幾組針對SEB相同功能域的抗體聯(lián)合應用后，T細胞增殖的抑制率在50%左右，對細胞因子釋放的抑制作用僅在32%左右，說明聯(lián)合應用不同功能域的抗體，對SEB的中和保護作用具有協(xié)同作用，而相同功能域的協(xié)同作用不顯著。 三、高效抗SEB雙可變區(qū)抗體的構建及功能鑒定 采用基因工程技術，構建了兩種結構的DVD抗體3E2-4A3和4A3-3E2，共轉染CHO細胞，瞬轉結果顯示，DVD3E2-4A3的結合活性要優(yōu)于DVD4A3-3E2。體內外實驗證明，DVD3E2-4A3抗體的體內外中和活性均強于單個親源抗體。同時發(fā)現(xiàn)DVD抗體較單個親源抗體具有更高的親和力（10倍），說明其高效的優(yōu)勢不僅是通過對MHCII和TCR功能域的雙阻斷，而且由于其更高的親和力，實現(xiàn)了對SEB的高效的中和保護作用。 本研究在前期獲得了10株SEB特異性單克隆抗體的基礎上，通過m3E2和SEB蛋白的共結晶，解析了SEB與抗體的作用界面，通過定點突變證實SEB46Y和71K為m3E2與其結合的關鍵氨基酸，探討了抗SEB抗體中和保護作用的結構基礎；進一步比較了幾株中和保護性抗體的協(xié)同作用，發(fā)現(xiàn)針對不同功能域的抗體之間具有協(xié)同作用，而同一功能域的中和保護性抗體的協(xié)同作用不顯著；在此基礎上，構建獲得了可同時結合SEB TCR和MHCII不同功能域的高效雙可變區(qū)抗體DVD3E2-4A3，并證實其中和保護作用優(yōu)于雙抗體的聯(lián)合使用。針對雙功能表位的雙可變區(qū)抗體可能成為抗SEB的新的治療策略，為研制抗SEB新型抗體類藥物作出了探索。
【圖文】：

水、灰塵都可找到。金葡菌所引起的疾病，最常見的有三大類：染，毛囊炎、癤子、嚴重者可引起敗血癥、腦膜炎、骨髓感染等染，通過污染的器械用品造成傷口化膿感染，注射部位化膿感染，等癥；三是由金黃色葡萄球菌腸毒素引起食物中毒。在美國由腸毒占整個細菌性食物中毒 33%，而在加拿大更是高達 45%，我國每事件也非常多。球菌腸毒素（SEs）是一類由革蘭氏陽性細菌葡萄球菌不同菌株分素，目前已報道的大約有二十多種血清型[1-8]，其中金黃色葡萄球因其超抗原的特性以及在中毒性休克綜合征發(fā)病中的特殊意義而倍序列與 SEC 和毒素休克綜合征毒素（TSST-1）40-60%同源，根據氨子量約為 28.5kD，為一單鏈多肽，蛋白質結構由 5 個 α 螺旋（圖組成 2 個區(qū)[10、11]，SEB 與 MHCII 結合的區(qū)域位于 α 螺旋 5 和 β 片SEB 的 T 細胞受體（TCR）結合區(qū)位于其頂部的四個不同區(qū)域：α3 的環(huán)部；β 片層 4 的尾部和 β 片層與 α 螺旋 5 的環(huán)部[13]。

圖 2 SEB 作用機制 外中毒性休克綜合征的主要致病毒素。0.004μg/kg 的劑量即可g/kg 的劑量則可引起死亡[17]。人體感染 SEB 后，可引起呼吸困成發(fā)熱、肺水腫、急性呼吸窘迫癥、中毒性休克、多臟器的衰，SEB 也可造成皮膚炎、慢性鼻炎、哮喘等，，其發(fā)病機制與 SE反應相關[19-22]。對 SEB 誘導的中毒性休克綜合征尚無非常有效的防治手段，IVIG）可減輕 SEB 誘導的炎性疾病的癥狀[23]。有研究者將一體用于防治小鼠或靈長類動物模型中 SEB 誘導的致死性休克（淋巴細胞活化后細胞因子的釋放[24、25]。多個研究小組也已證實 具有一定的中和保護作用[26-30]，且抗體滴度的高低跟中和保護究者用識別SEB MHCII或TCR Vβ結合位點的小分子片段來制
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R392

【參考文獻】

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1 陳立杰;劉振世;董邦權;楊琨;李琦;金伯泉;;酶聯(lián)免疫發(fā)光法檢測金葡菌腸毒素(SE)B和SEC1方法的建立[J];細胞與分子免疫學雜志;2006年05期

2 邱陽,王剛,盧行安;PCR技術檢測食品中金黃色葡萄球菌腸毒素B基因[J];中國微生態(tài)學雜志;2004年02期

3 韓云坤;孫冰;李麗紅;孫利煒;;川崎病T細胞免疫及細胞因子變化的研究[J];中國實驗診斷學;2011年09期

本文編號：2591867