【摘要】：蛋白質(zhì)的正確折疊是行使正常的生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。某些錯(cuò)折疊疾病 ，特別是神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生與蛋白質(zhì)的構(gòu)象轉(zhuǎn)換和異常積聚緊密相關(guān)。 蛋白質(zhì) GIgG 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（PGBD）具有緊密的折疊結(jié)構(gòu)和很強(qiáng)的穩(wěn)定性，是研究序列插入和置換的理想模型。我們?cè)O(shè)計(jì)了兩個(gè)嵌合體蛋白，即將 PGBD中的α 螺旋肽段序列替換為蛋白質(zhì)LIgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域（PLBD）中的α 螺旋序列或者β 2 折疊序列，并將其分別命名為PGBDLα 和PGBDLβ 。相對(duì)于野生型PGBD而言，PGBDLα中的α 螺旋含量減少，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性下降；而PGBDLβ的結(jié)構(gòu)則變?yōu)闊o(wú)序。因此，這些結(jié)果表明不同類(lèi)型的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元在同一結(jié)構(gòu)環(huán)境中的結(jié)構(gòu)構(gòu)象形成具有明顯差別；蛋白質(zhì)肽段的結(jié)構(gòu)形成趨勢(shì)及側(cè)鏈相互作用對(duì)該單元的二級(jí)結(jié)構(gòu)形成具有重要影響。 通過(guò)氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)，在Aβ 肽、prion蛋白和α synuclein 蛋白（α Syn）等易積聚的蛋白質(zhì)中都存在一段疏水性的同源序列VGGA VV AGV ，，我們將其命名為 GAV 基序。分別將該序列插入到PGBD序列中部的loop區(qū)（GAVINS ）和 C端（ GAV CT ），形成兩個(gè)突變體蛋白。生物物理學(xué)方法得到的信息，特別是原子力顯微鏡（AFM ）圖譜顯示，GAVINS形成了積聚物， 而GAVCT 沒(méi)有。 這一結(jié)果說(shuō)明雖然 GAV基序具有積聚能力，但是積聚形成還與該序列的周?chē)h(huán)境以及與在蛋白質(zhì)中所處的位置有關(guān)。 通過(guò)定點(diǎn)突變結(jié)合 thioflavin T（ThT ）熒光檢測(cè)、 AFM以及細(xì)胞毒性分析等實(shí)驗(yàn)，我們首次報(bào)道了九肽序列VGGA VVTGV對(duì)于 α Syn 蛋白的纖維化 以及 PC12 細(xì)胞的毒性產(chǎn)生是必需的， 該序列的缺失會(huì)阻止 α Syn 蛋白的纖維化 以及對(duì) PC1 2 細(xì)胞的毒性作用。同時(shí)， α Syn 蛋白中第 68 位的 Gly 替換為 Ala 以及截短其C端區(qū)域（如α Syn 1 74和 α Syn1 100） 都 能大大加速蛋白質(zhì)的纖維化 進(jìn)程。CD譜顯示，蛋白質(zhì)纖維化 的過(guò)程中往往伴隨有 β 折疊結(jié)構(gòu)的形成。另 外，我們還利用種子積聚實(shí)驗(yàn)、引入色氨酸熒光探針、 TFE 誘導(dǎo)的構(gòu)象轉(zhuǎn)換以 及固相 CD 譜等方法，進(jìn)一步對(duì) α Syn 蛋白的積聚性質(zhì)進(jìn)行了研究。以上結(jié)果 對(duì)于我們理解蛋白質(zhì)纖維化的分子機(jī)制，發(fā)展治療神經(jīng)退行性疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng) 物模型及輔助治療藥物具有重要意義。 WP=3 我們還化學(xué)合成了 VGGA VV AGV九肽片段，并在體外研究了其積聚能力。 在一定的條件下， GA V 九肽不僅自身很容易組裝成纖維積聚物， 而且它還能夠 加快 α Syn 蛋白的積聚速率。這些結(jié)果再次說(shuō)明了該序列在蛋白質(zhì)積聚中的核 心作用。
【圖文】：

第一章 PGBD嵌合體的二級(jí)結(jié)構(gòu)形成和構(gòu)象轉(zhuǎn)換結(jié)果與討論1.2.1 蛋白質(zhì)表達(dá)條件的優(yōu)化三種 PGBD 均克隆于 pET-3a 表達(dá)質(zhì)粒中，以 BL21(DE3)作為表達(dá)宿主菌。圖 1-2A 顯示為不同 IPTG 濃度下的 PGBDLα表達(dá)情況。從圖中可以看出，目標(biāo)蛋白在 0.4 mM I PTG 存在下，誘導(dǎo) 6 小時(shí)表達(dá)量可達(dá)到最大。同時(shí)我們也摸索了誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)量的影響（圖 1-2B），發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo) 3 小時(shí)以后，表達(dá)量差別不大。在不影響蛋白質(zhì)表達(dá)量和避免蛋白質(zhì)降解的前提下，適當(dāng)延長(zhǎng)表達(dá)時(shí)間會(huì)提高蛋白質(zhì)的表達(dá)總量。(A) (B)

最終結(jié)果如下：37 ℃下蛋白質(zhì)名稱(chēng) [IPTG]（mM）誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間(hr)蛋白質(zhì)的表達(dá)量 (mg)(每升 LB 培養(yǎng)基)PGBD-WT 0.01 6 ~ 8 ~ 50PGBDLα 0.4 5 ~ 6 ~ 30PGBDLβ 0.01 6 ~ 7 ~ 351.2.2 PGBD 的表達(dá)和純化在 LB培養(yǎng)基中三種 PGBD的表達(dá)量可占總蛋白量的 30%以上，而且它們的過(guò)量表達(dá)不會(huì)影響菌株的正常生長(zhǎng)，最終每升菌能純化到 30 mg以上的蛋白質(zhì)。在 M9 培養(yǎng)基中，蛋白表達(dá)量略有下降，SDS-PAGE 顯示，表達(dá)量占總蛋白量的 20%，每升菌能純化到約 20 mg 的蛋白質(zhì)，完全能夠滿(mǎn)足核磁共振（NMR）實(shí)驗(yàn)的需要。對(duì)于純化好的蛋白質(zhì)要進(jìn)行分子量測(cè)定（圖 1-3）和
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)院研究生院（上海生命科學(xué)研究院）
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類(lèi)號(hào)】：Q51

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 胡紅雨,許根俊;蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;1999年01期

本文編號(hào)：2590782