【摘要】：流感(Influenza)是一種嚴(yán)重威脅人類健康和公共衛(wèi)生安全的呼吸道傳染病,A型流感病毒(influenza A virus, IAV)是其主要病原體。IAV是一種基因組分8個(gè)節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒,各基因組片段RNA的主要結(jié)構(gòu)組成包括一個(gè)長(zhǎng)的編碼區(qū)和位于兩端較短的非編碼區(qū)。從基因的分類來(lái)看,流感病毒基因?qū)儆谡婧嘶虻姆懂?而真核基因的非編碼區(qū)序列作為重要的順式作用元件對(duì)基因的表達(dá)調(diào)節(jié)發(fā)揮著重要的作用。但是,目前對(duì)流感病毒基因組非編碼區(qū)在病毒基因表達(dá)調(diào)節(jié)過(guò)程中所發(fā)揮的作用還缺少系統(tǒng)性研究。而這一問(wèn)題的深入研究,對(duì)于我們進(jìn)一步了解病毒的復(fù)制與致病機(jī)制有重要理論意義,也將為疾病的防治工作提供重要信息。 在本研究中,我們通過(guò)生物信息學(xué)方法,對(duì)流感病毒各基因片段的非編碼區(qū)進(jìn)行了大規(guī)模序列比對(duì)分析,全面展示了流感病毒非編碼區(qū)的序列特征。在此基礎(chǔ)上,我們?cè)诹鞲胁《拘⌒蛷?fù)制子系統(tǒng)中研究了各基因片段的非編碼區(qū)對(duì)于病毒RNA合成和蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果表明,流感病毒各基因片段的非編碼區(qū)不但對(duì)病毒RNA合成有著重要影響,而且能夠在翻譯水平上對(duì)病毒蛋白的表達(dá)發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用。其中最為明顯的是,PB1基因非編碼區(qū)在翻譯水平介導(dǎo)了相對(duì)低水平的蛋白表達(dá)。 我們的研究發(fā)現(xiàn),在PB1基因的非編碼區(qū)內(nèi),以基因-3位堿基“U”為特征的非優(yōu)勢(shì)Kozak序列導(dǎo)致了PB1非編碼區(qū)在翻譯水平介導(dǎo)了蛋白的低水平表達(dá)。通過(guò)在該位點(diǎn)引入-3U-A突變優(yōu)化PB1基因的Kozak序列,雖然能夠提高突變病毒在感染過(guò)程中PB1蛋白的表達(dá)量,但該突變病毒在復(fù)制過(guò)程中所能達(dá)到的最高滴度要比野生型病毒低10倍,即呈弱毒表型。進(jìn)一步的研究表明,優(yōu)化PB1基因的Kozak序列所引起的PB1蛋白的過(guò)表達(dá),不但致使突變病毒RNA合成動(dòng)態(tài)發(fā)生改變,而且使得突變病毒誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生了較高水平的Ⅰ型干擾素。 另外,我們對(duì)流感病毒非編碼區(qū)中毗鄰于病毒啟動(dòng)子的保守堿基(3’端13-14位堿基與5’端14'-16’位堿基)的功能進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,3’端13位堿基與5’端14’位堿基所形成堿基配對(duì)使得啟動(dòng)子的“莖”部進(jìn)一步得到了延伸,這對(duì)于病毒啟動(dòng)子功能的發(fā)揮非常關(guān)鍵。同時(shí),研究結(jié)果也提示我們,這些保守的堿基序列還可能參與了如病毒基因組RNA的包裝等病毒復(fù)制周期中的其他過(guò)程。 總之,本研究全景展示了流感病毒各基因片段非編碼區(qū)的序列特征,并比較全面地研究了其對(duì)于病毒RNA合成與蛋白表達(dá)的影響。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步揭示了PB1非編碼區(qū)在翻譯水平上介導(dǎo)PB1低水平表達(dá)的機(jī)制和生物學(xué)意義,即流感病毒在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中,其PB1基因獲得了一個(gè)高度保守和特異的非優(yōu)勢(shì)Kozak序列來(lái)調(diào)節(jié)PBl蛋白的表達(dá)量,從而優(yōu)化病毒復(fù)制動(dòng)力學(xué)和避免過(guò)度激活宿主抗病毒天然免疫應(yīng)答。另外,我們還初步揭示了病毒片段特異性非編碼區(qū)中毗鄰于病毒啟動(dòng)子的保守核苷酸殘基的功能。上述研究的完成,進(jìn)一步豐富了我們對(duì)于A型流感病毒非編碼區(qū)的認(rèn)識(shí),也為我們理解A型流感病毒的基因表達(dá)調(diào)控和病毒免疫逃避機(jī)制提供了一個(gè)新的視角。
【圖文】：

導(dǎo)致流感的大流行。在過(guò)去500多年中，從1510年起，世界范圍內(nèi)大約有14次A型流感病毒的大流行（圖1-4)。而在過(guò)去的120年中，A型流感病毒大流行分別發(fā)生在1889年、1918年、丨957年、1968年、1977年和2009年丨丨63!。在1918年第一次世界大戰(zhàn)期間，世界范圍內(nèi)爆發(fā)了人類有記載歷史上最為嚴(yán)重的一次流感大流行。據(jù)估計(jì),此次大流行在世界范圍內(nèi)導(dǎo)致將近5 T?萬(wàn)人死亡,而僅在美國(guó)就有將近67.517

唆（Uridine, U)組成的序列。這一段序列被證明是病毒在合成mRNA過(guò)程中，是在3'加Pol(A)尾的多聚腺苷酸化信號(hào)序列(如圖1-5)[179]。ssNCRs Coding region ssNCRs3,、丨 I穴^UUUU圖1-5流感病毒基因組結(jié)構(gòu)意圖1.2.2流感病毒非編碼區(qū)內(nèi)的病毒啟動(dòng)子過(guò)去的大量研究己經(jīng)表明，流感病毒基因組RNA高度保守的3'端的12個(gè)核苷酸殘基和5'端的13個(gè)核苷酸殘共同形成了流感病毒的vRNA啟動(dòng)子3'端保守的10-12位核苷酸殘基與5'端11'-13'位保守的核苷酸殘基通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)使得病毒RNA首尾相連形成一環(huán)狀狀結(jié)構(gòu)此外，，人們還發(fā)現(xiàn)，3'端和5'端的蓮-環(huán)結(jié)構(gòu)對(duì)于流感病毒啟動(dòng)子功能有重要作用。首先，3'端和5'端的蓮-環(huán)結(jié)構(gòu)的存在是流感病毒聚合酶發(fā)揮其內(nèi)切酶活性從宿主細(xì)胞mRNA _h獲取帽子結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵；另夕卜，5'端的蓮-環(huán)結(jié)構(gòu)對(duì)于病毒mRNA的末端的多聚腺苷酸化非常重要而且，研宄也已經(jīng)表明，這些蓮-環(huán)結(jié)構(gòu)起到了病毒RdRp結(jié)合與固定的作用II87]。所以科學(xué)家提出了現(xiàn)在已經(jīng)被人們廣泛接受的流感病毒啟動(dòng)子的Corkscrew結(jié)構(gòu)模型[184.188](圖 1_6)。20
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R373.13


本文編號(hào)：2589974