【摘要】：神經(jīng)鞘氨醇磷酸膽堿（Sphingosylphosphorylcholine,SPC）是神經(jīng)鞘磷脂的一種代謝產(chǎn)物。人們開始發(fā)現(xiàn)SPC是Niemann Pick�。∟PD）中沉積的鞘脂類，后來發(fā)現(xiàn)SPC有很強的促有絲分裂作用，明顯促進3T3成纖維細胞DNA合成，且能增加細胞數(shù)。這種促有絲分裂作用明顯強于表皮生長因子、胰島素等，而且與它們有協(xié)同作用。在愈合能力差的糖尿病小鼠實驗中證實，SPC具有促進多種細胞增殖、傷口愈合和減少瘢痕形成等作用，從此SPC受到很多學(xué)者的關(guān)注。最近發(fā)現(xiàn)SPC促進細胞的移動，誘導(dǎo)成纖維細胞表達與細胞移動有關(guān)的血纖維蛋白溶酶原激活劑。有實驗證實SPC不僅在創(chuàng)傷愈合的組織形成期起作用，而且在組織再塑期同樣起重要的作用�？梢�，SPC在創(chuàng)傷愈合的多個階段均起重要的促進作用。 創(chuàng)傷愈合是非常復(fù)雜的生物學(xué)過程。本研究利用基因芯片技術(shù)和SSH技術(shù)，重點研究了SPC刺激人皮膚成纖維細胞時基因表達譜的變化，在基因水平上研究SPC促進創(chuàng)傷愈合的機理，同時研究了SPC刺激人皮膚成纖維細胞誘導(dǎo)表達CTGF時部分信號傳遞途徑。 結(jié)果如下： 1. SPC對原代培養(yǎng)的人皮膚成纖維細胞DNA合成影響 （1）SPC對原代培養(yǎng)的成纖維細胞DNA合成的促進作用有濃度依賴性； WP=101 低濃度時有促進作用即 2μM時就有促進作用，5 μM 時 達最高值，超過20 μM時則出現(xiàn)毒性作用，DNA合成不僅不增加反而出現(xiàn)細胞退化。 （2）SPC以5 μM濃度處理24h、48h、72h后DNA合成速度明顯較對照組高，這表明SPC處理長達72h 時，SPC仍有明顯的促進DNA合成作用，這種持久性的作用有可能與它的長半衰期（半衰期18 h）有關(guān)。 利用基因芯片技術(shù)研究SPC作用人皮膚成纖維細胞時基因表達譜的變化 基因芯片的8096個基因中有意義的信號位點有194個，其中表達增加 2倍以上的基因為52個、表達減少一半以下的基因為49個。 根據(jù)基因功能初步將它分為11類: 第一類是與細胞增殖有關(guān)的基因， 共3個；第二類是與細胞骨架、細胞移動、細胞外基質(zhì)產(chǎn)生等有關(guān)的基因，共16個；第三類是轉(zhuǎn)錄因子及轉(zhuǎn)錄因子激活劑，6個; 第四類為核糖體蛋白，1個；第五類為抑制腫瘤有關(guān)的基因，共3個；第六類是免疫、炎癥和細胞因子有關(guān)的基因，共4個；第七類是代謝有關(guān)的基因，共7個；第八類是DNA、蛋白等結(jié)合有關(guān)的基因，共5個; 第九類是凋亡及應(yīng)激蛋白有關(guān)的基因，共1個；第十類是離子通道有關(guān)的基因，共5個；第十一類是其他功能或不知功能的基因，共17個；11類基因中7類基因可能與創(chuàng)傷愈合有關(guān)，其中與創(chuàng)傷愈合密切關(guān)聯(lián)的幾個基因是CTGF、Cyr61、 PA、 PAI、 IL-6、 tubuline、 actin like- 7A、 transgelin、 TNF-α-induced protein 6 等。這些基因中CTGF表達水平最高，因此我們認為SPC 促進創(chuàng)傷愈合過程中CTGF是重要的下游因子。 3. 利用SSH方法研究SPC作用人皮膚成纖維細胞時差異表達的基因 WP=102 采用SSH技術(shù)從 SPC處理組的264個白色菌落中查出28個差異表達克隆，從對照組的196個白色菌落中篩查出26個差異表達克隆。利用Northern 印跡，從 SPC處理組差異表達的28個克隆中確定了6個差異表達基因，對照組26個差異表達克隆中沒有確定差異表達克隆。對6個差異表達克隆插入序列的分析表明, 克隆FBSPCT02G 的同源性基因是 Homo sapiens thrombospondin 1 -THBS1,克隆FBSPCT04A的同源性基因是Homo sapiens transferrin receptor -TFRC，克隆FBSPCT04H的同源性基因是 H.sapiens mRNA for oxytocin receptor，克隆FBSPCT07E的同源性基因是Homo sapiens zinc finger transcription factor-ZNF207 mRNA, 克隆FBSPCT06E的同源性基因是 Homo sapiens matrix metalloproteinase 2 -MMP2，克隆FBSPCT08F是新基因。 4. 利用Northern 印跡技術(shù)分析SPC處理后人皮膚成纖維細胞CTGF mRNA的表達 以不同濃度的SPC作用人皮膚成纖維細胞時，CTGFmRNA的表達隨著SPC的濃度的增高而增高。SPC的濃度為1μM~5μM時，CTGFmRNA表達明顯較0 μM時高，10μM時CTGFmRNA表達有下降趨勢，但仍處于較高水平。當(dāng)SPC濃度為5μM，觀察不同作用時間對CTGFmRNA表達的影響，，發(fā)現(xiàn)作用時間為3h時CTGFmRNA表達沒有明顯的變化，6h時CTGFmRNA表達明顯的較0h 增高，12h時CTGFmRNA表達繼續(xù)保持在較高水平，但24h時CTGFmRNA表達顯著下降。 WP=103 5. 利用Western 印跡分析SPC處理后人皮膚成纖維細胞CTGF蛋白表達 不同濃度的SPC 處理24h后觀察CTGF蛋白表達。當(dāng)SPC濃度為0.5 ??到???時，在38 kDa分子量位置上出現(xiàn)陽性條帶，均較0??表達增高。 利用Northern 印跡技術(shù)分析放線菌酮預(yù)處理后SPC 誘導(dǎo)CTGFmRNA表達的變化 當(dāng)單用SPC處理時CTGFmRNA表達較對照組顯著增高。單用蛋白合成抑制劑放線菌酮（cycloheximide -CHX)以 10 ?g/ml CHX處理時，CTGFmRNA表達明顯較單用SPC處理組增高。當(dāng)SPC與CHX同時處理時，CTGFmRNA表達更加顯著，較單用CHX處理組高。這結(jié)果提示SPC誘導(dǎo)CTGFmRNA表達是直接作用于CTGFmRNA轉(zhuǎn)錄，且 SPC誘導(dǎo)CTGFmRNA表達時受某些因子的抑制，當(dāng)放線菌酮（CHX）抑制了這些因子時CTGFmRNA的表達增高。 7. 利用 RT-PCR方法分析百日咳毒素預(yù)處理后SPC 誘導(dǎo)人皮膚成纖維細胞CTGFmRNA表達 不同濃度
【圖文】：

親和力的 SPC- GPCRs 已被鑒定。這些受體不被 S1P 所激活[12，13]，而且也證明了 SPC 在正常的血漿中可以檢測到。1． SPC 的結(jié)構(gòu)與作用機制1．1 SPC 的結(jié) SPC 由鞘氨醇及磷酸膽堿所構(gòu)成。分子式：C23H49N2O5P，分子量：464.6，在體內(nèi)還有很多結(jié)構(gòu)上與 SPC 相近且生理學(xué)作用也較相近的溶血磷脂類（見圖 1）。

圖 2. SPC 作用的分子生物學(xué)機制1．2. 1 G-蛋白耦聯(lián) SPC 受體（G-protein-coupled SPC receptors）就象 S1P，G-蛋白耦聯(lián)受體抑制劑百日咳毒素（pertussis toxin PTX）阻斷 SPC 對細胞的作用；這個現(xiàn)象可以提示，SPC 是通過 GPCRs 對細胞起作用的[14]。在豚鼠心肌細胞 第一次證明了特異性神經(jīng)鞘脂-GPCR 存在的事實。S1P 在 nM 水平上以 GTP 依賴形式激活細胞膜外側(cè)面的 muscarinic current channels (Ik(Ach)) Ik.Ach[15]。SPC 也高度類似的方式激活 Ik.Ach[16]，可以提示 SPC 與 S1P 作為配體對此受體均有高親和力的，但是后來證明 ED家族的 S1P 受體對 SPC 來說是低親和力的（見表 1） 。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R346

【共引文獻】

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本文編號：2589896