【摘要】：利用血管生成抑制來(lái)治療腫瘤是目前研究的熱點(diǎn)之一。纖溶酶原K5(Plasminogen K5，Pgn K5)是一種新發(fā)現(xiàn)的血管生成抑制蛋白，具有明顯的血管生成抑制作用，但Pgn K5的抗腫瘤活性尚待確定，此外，選擇何種表達(dá)系統(tǒng)制備足夠的量進(jìn)行體內(nèi)抗腫瘤活性研究還需要進(jìn)一步探索。本論文就Pgn K5在原核和真核系統(tǒng)的表達(dá)、純化及生物學(xué)活性的測(cè)定等進(jìn)行了系統(tǒng)詳細(xì)的研究。 首先，按照酵母細(xì)胞遺傳密碼偏愛(ài)性設(shè)計(jì)并人工合成hK5(人Pgn K5)的全基因，插入大腸桿菌表達(dá)載體pThioHisA，以硫氧還蛋白融合蛋白的形式實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。經(jīng)腸激酶切割和純化，獲得了與天然蛋白N-末端相同的hK5重組蛋白。 另外，將hK5基因插入畢赤酵母整合型表達(dá)質(zhì)粒p819的醇脫氫酶(AOX)啟動(dòng)子下游，構(gòu)建攜帶8拷貝hK5表達(dá)盒的重組載體，經(jīng)電轉(zhuǎn)化GS115菌株和G418篩選，得到了高效分泌表達(dá)hK5的畢赤酵母菌株，表達(dá)量超過(guò)150mg／L，通過(guò)DEAE-Sepharose離子交換層析和Sephadex G-75凝膠過(guò)濾純化，使重組蛋白達(dá)到很高的純度。 最后，對(duì)大腸桿菌和畢赤酵母表達(dá)的hK5的活性進(jìn)行鑒定。Ecv304細(xì)胞(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞系)生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)表明，hK5以劑量依賴的方式特異性地抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn)中，hK5可顯著抑制新生血管的形成。T739小鼠腫瘤模型實(shí)驗(yàn)表明，重組hK5可顯著降低小鼠腫瘤的生長(zhǎng)速度。 本研究首次報(bào)道了重組hK5在大腸桿菌和畢赤酵母系統(tǒng)中的表達(dá)以及體內(nèi)抗腫瘤活性測(cè)定，為hK5的活性機(jī)理研究和新型抗血管生成藥物開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士研究生圈1.8助KS融合蛋白親和層析純化Figl.SA擊正yt山mooatgra討WPur迅。麗曲of公區(qū)susfnoiProtoni

100荃因的PCR擴(kuò)增斷catinoof-aKSusfnoigO.“.K5n場(chǎng)inognee(583如);.2PCR夢(mèng)doCutofKSco山叩閱noi51甲川陰卿即“(2，OPb);M.DNA屁OIlCe過(guò)arsat公恤drD卜200.0表達(dá)盒的重組質(zhì)粒構(gòu)建P819一-aKS的構(gòu)建表明，-aKS基因以正確的方向插入了Psgl醉點(diǎn)。DNA序列分析表明，，基因序列正確。酶切鑒錄。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2001
【分類號(hào)】：R346

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2589243