【摘要】：干細(xì)胞具有自我更新能力和多向分化潛能，是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的理想細(xì)胞。成體干細(xì)胞是存在于發(fā)育成熟個(gè)體組織中的可自我更新和分化為源組織所有細(xì)胞類型的未分化細(xì)胞。近年來，研究發(fā)現(xiàn)在成體組織中還存在具有向多胚層組織細(xì)胞發(fā)育潛能的多能干細(xì)胞，并已顯示出良好的治療前景。皮膚是人體最大的器官，由上皮組織和和真皮組織組成，包括來源于三個(gè)胚層的多種不同的組織細(xì)胞，自我更新和再生修復(fù)速度快，是成體干細(xì)胞分離和研究的良好對(duì)象。基于目前對(duì)皮膚上皮干細(xì)胞(包括表皮干細(xì)胞和毛囊干細(xì)胞)的研究進(jìn)展和皮膚上皮組織和真皮組織在發(fā)育來源、解剖結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能等方面的密切關(guān)系，可以推測(cè)在真皮組織中也存在干細(xì)胞。20世紀(jì)90年代，真皮組織干細(xì)胞的研究取得了重要進(jìn)展。國內(nèi)外的幾個(gè)研究小組均報(bào)道從真皮組織中分離獲得了成體多能干細(xì)胞，并證實(shí)這些細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖和分化潛能，可以分化為平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞甚至神經(jīng)細(xì)胞等多種組織細(xì)胞，從而為真皮多能干細(xì)胞的存在提供了直接的證據(jù)。研究還表明，真皮多能干細(xì)胞與骨髓基質(zhì)來源的另一種成體多能干細(xì)胞——間充質(zhì)干細(xì)胞在細(xì)胞表型等生物學(xué)特性方面具有一定差別，因此可排除所研究的真皮多能干細(xì)胞為經(jīng)血循環(huán)遷移至皮膚的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的可能，進(jìn)一步支持真皮多能干細(xì)胞的客觀存在。真皮組織來源方便，且可取用自體組織，有望成為細(xì)胞移植、基因治療和組織工程中成體干細(xì)胞的一個(gè)新來源。 創(chuàng)傷愈合是一個(gè)復(fù)雜的過程，是在多種不同的細(xì)胞成分和局部微環(huán)境的相互作用下完成的。在創(chuàng)傷愈合的過程中，不同的細(xì)胞成分被微環(huán)境激活，然后在損傷局部遷移和增殖，參與組織修復(fù)。目前的研究表明，體內(nèi)局部組織特異性的微環(huán)境決定了干細(xì)胞的可塑性。真皮主要由成纖維細(xì)胞和其分泌的富含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)成分組成，具有重要的生理功能，同時(shí)為皮膚提供支持和營養(yǎng)。鑒于創(chuàng)傷愈合中成纖維細(xì)胞的來源仍存在爭(zhēng)議，我們?cè)O(shè)想真皮組織中的多能干細(xì)胞可能是成纖維細(xì)胞的祖細(xì)胞，在創(chuàng)傷后被激活，通過增殖、遷移和分化而參與修復(fù)過程。至今為止，關(guān)于創(chuàng)傷后表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的激活過程已經(jīng)被廣泛研究，但對(duì)于真皮多能干細(xì)胞在愛創(chuàng)傷愈合中的作用和調(diào)控機(jī)制則所知甚少。同時(shí)，作為又一種具有良好前景的成體多能干細(xì)胞的來源，真皮多能干細(xì)胞是否和目前研究最深入的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有類 第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 似的功能特性也是值得關(guān)注的問題。 在本研究中，我們先從人和大鼠的真皮組織中分離鑒定了多能干細(xì)胞，進(jìn)而篩選 獲得了一純化的可體外大量擴(kuò)增的多能干細(xì)胞克隆，然后通過一系列實(shí)驗(yàn)來揭示其重 要生物學(xué)特性和在多種不同創(chuàng)傷模型中促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)與造血恢復(fù)的作用。研究結(jié)果顯 示，真皮多能干細(xì)胞可以參與創(chuàng)傷修復(fù)，并具有促進(jìn)造血恢復(fù)的作用:進(jìn)一步在放創(chuàng) 復(fù)合傷動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)真皮多能干細(xì)胞移植可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)提高存活率，，促進(jìn)造血與創(chuàng) 面愈合的多重治療作用，為復(fù)合傷和多發(fā)傷等嚴(yán)重創(chuàng)傷的治療提供了新的思路和途徑. 在實(shí)驗(yàn)中，我們還發(fā)現(xiàn)了體外培養(yǎng)條件下，真皮多能干細(xì)胞發(fā)生自發(fā)惡性轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象。 鑒于干細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化與其安全應(yīng)用密切相關(guān)，因此對(duì)真皮多能干細(xì)胞體外自發(fā)惡性 轉(zhuǎn)化后重要的生物學(xué)性狀的改變及其發(fā)生機(jī)制作了進(jìn)一步研究。本研究取得的主要結(jié) 果和結(jié)論如下: 1、真皮多能細(xì)胞的分離、鑒定和生物學(xué)性狀研究。采用貼壁篩選的方法，從新生 大鼠背部和成人包皮與毛囊真皮組織中分離鑒定了成體多能干細(xì)胞，經(jīng)多向分化誘導(dǎo) 實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有多向分化潛能，提示人和大鼠的真皮組織中均含有多能干細(xì)胞;在此 基礎(chǔ)上，采用低密度連續(xù)稀釋法，從新生大鼠真皮組織中成功獲得一純化的可體外培 養(yǎng)擴(kuò)增的多能干細(xì)胞克隆，并對(duì)其生物學(xué)性狀和功能特性進(jìn)行了研究。免疫細(xì)胞化學(xué) 和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志分子結(jié)果顯示:真皮多能干細(xì)胞表達(dá)CD44、CD59、 CD90、ICAM一1、VCAM一1、I型膠原和m型膠原等分子，但不表達(dá)上皮細(xì)胞、血管內(nèi) 皮細(xì)胞和造血細(xì)胞特異性的pan一eytokeratin、eytokeratinlg、Factor Vlll、cD31、CD45 和CD34等分子，也不表達(dá)CD4分子。在成骨、軟骨、脂肪和神經(jīng)細(xì)胞特異性誘導(dǎo)體 系作用下，真皮多能干細(xì)胞表達(dá)成骨細(xì)胞(堿性磷酸酶和鈣鹽染色)、軟骨細(xì)胞(n型 膠原和細(xì)胞外基質(zhì)染色)、脂肪細(xì)胞(脂滴合成和油紅染色)和神經(jīng)細(xì)胞(nestin和NF一200 染色)特異性的標(biāo)志分子，提示多能干細(xì)胞具有多向分化潛能，支持篩選的細(xì)胞克隆 為多能干細(xì)胞。體外培養(yǎng)過程中，細(xì)胞增殖迅速;細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示:約90%細(xì) 胞處于GO/GI期，10%處于S期，提示只有少數(shù)細(xì)胞處于增殖期。傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞 呈貼壁狀態(tài)均勻生長。細(xì)胞群體平均倍增周期約40小時(shí)，體外培養(yǎng)8一10天即可進(jìn)入 生長的平臺(tái)期;傳代培養(yǎng)至20代，細(xì)胞的增殖能力和分化潛能未見明顯改變。應(yīng)用基 因芯片對(duì)體外培養(yǎng)真皮多能千細(xì)胞的基因表達(dá)譜進(jìn)行了研究，檢測(cè)結(jié)果表明:真皮多 能干細(xì)胞表達(dá)多種細(xì)胞類型特定的轉(zhuǎn)錄子，包括骨細(xì)胞、肌肉、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì) 胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、造血細(xì)胞等
【圖文】：

圖l:(A)體外培養(yǎng)的原代真皮多能干細(xì)胞，xloo;(B)細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果采用廣譜的分化誘導(dǎo)物一地塞米松來檢測(cè)細(xì)胞的分化能力，結(jié)果顯示:luM地塞米松作用4周后，細(xì)胞鈣鹽染色和軟骨染色均呈陽性，提示分離細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)可向成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化(圖ZA，B);進(jìn)而選擇一種成骨特異性的誘導(dǎo)因子BMP一2作用培養(yǎng)的細(xì)胞，結(jié)果顯示:培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)BMP一2的誘導(dǎo)呈現(xiàn)出明顯的反應(yīng)性，0.lug/mlBMP一2誘導(dǎo)3天后，光鏡下可見細(xì)胞聚集成簇，既繼而細(xì)胞分泌黑色顆粒，分泌物堆積成云霧狀黑色小節(jié)，最后形成鈣結(jié)節(jié)，組織染色證實(shí)堿性磷酸酶和鈣鹽均呈陽性。通過上述結(jié)果可以初步鑒定具有多向分化潛能特性的細(xì)胞克隆即為真皮多能干細(xì)胞。

部分貼壁細(xì)胞成克隆樣生長，細(xì)胞在最初2周內(nèi)，生長不明顯，但其后增殖加快，融合成片。挑取生長良好的細(xì)胞克隆進(jìn)行誘導(dǎo)分化，4周后，可觀察到到鈣結(jié)節(jié)和脂肪細(xì)胞的形成(圖3)，鈣鹽染色和脂肪染色也呈陽性，表明人真皮組織中也含有多能千細(xì)胞。圖3:原代培養(yǎng)人包皮真皮多能干細(xì)胞和誘導(dǎo)分化。(A)成骨誘導(dǎo)分化后形成的鈣結(jié)節(jié);x4o(B)成脂誘導(dǎo)分化后形成的脂肪細(xì)胞�！�200進(jìn)一步從人頭皮組織分離毛囊的毛乳頭細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，可見毛乳頭細(xì)胞從毛乳頭周圍長出，向四周呈放射性生長，細(xì)胞多為三角形和長梭形，大約2周后細(xì)胞融合成片，中央?yún)^(qū)為多層細(xì)胞凝集生長，顯示出毛乳頭細(xì)胞體外具有凝集性生長的特性。為檢測(cè)是否毛乳頭細(xì)胞中是否也具有多能千細(xì)胞的活性，將單個(gè)毛乳頭進(jìn)行培養(yǎng)，待毛乳頭細(xì)胞生長融合以后，進(jìn)行誘導(dǎo)分化，結(jié)果顯示;在培養(yǎng)體系中產(chǎn)生了鈣鹽染色陽性的成骨細(xì)胞和油紅染色陽性的脂肪細(xì)胞(圖4)，而對(duì)照未誘導(dǎo)組未能檢測(cè)出上述染色陽性細(xì)胞。由于毛乳頭細(xì)胞是一類高度特異的成纖維細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R329.2

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 羅琳;付建華;汪泱;;真皮間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性研究進(jìn)展[J];江西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn);2007年01期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 史明艷;山羊毛囊干細(xì)胞及組織工程皮膚構(gòu)建研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2006年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 黃林生;雞胚真皮間充質(zhì)干/祖細(xì)胞分離培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化研究[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

本文編號(hào)：2587544