【摘要】：由于缺乏有效的預防和治療手段,H5N1病毒仍是威脅全球健康的一個嚴重的長期隱患。在人感染HSN1病毒的多數(shù)病例中,HSN1病毒能引起嚴重的臨床癥狀,導致病情快速惡化和病人極高的病死率。許多研究都試圖揭示其毒力增強的遺傳基礎和致病機理,較強的病毒復制能力和病毒感染引起的細胞因子風暴被認為在其致病機理中占重要位置。利用高通量組學研究手段,解析H5N1病毒和宿主細胞之間的相互作用,找到在H5N1病毒生活周期中起重要作用的宿主因子,將有助于開發(fā)更為廣譜且不易產(chǎn)生耐藥性的治療藥物。 本文研究的主要對象類泛素蛋白FAT10(又稱泛素D, Ubiquitin D, UBD)即是從H5N1病毒感染小鼠肺組織的基因表達譜分析中篩選出來的一個重要宿主因子。我們發(fā)現(xiàn)H5N1病毒的感染在小鼠肺組織和多種人呼吸道上皮細胞中均能夠引起FAT10表達水平顯著升高。進一步的研究表明,FAT10在H5N1病毒復制過程中起重要作用。敲減FAT10蛋白能夠抑制H5N1病毒M1基因和NP蛋白的表達。通過對FAT10ylation系統(tǒng)重要組分UBA6和USE1的敲減實驗表明,FAT10ylation系統(tǒng)在H5N1病毒復制中也發(fā)揮重要作用。 通過對H5N1病毒蛋白及dsRNA類似物poly (IC)的篩選,我們發(fā)現(xiàn)poly (IC)能夠通過RIG-1-p65通路誘導FAT10表達顯著上調(diào)。在對FAT10下游作用蛋白的研究中發(fā)現(xiàn),H5N1病毒感染時p62能夠作為FAT10底物與其結合。敲減p62后H5N1病毒M1和NP表達水平顯著升高,說明p62對H5N1病毒的復制起限制性作用。HSN1病毒感染后能引起STAT1磷酸化水平升高,而敲減p62能使這一過程中的STAT1磷酸化水平降低,提示p62參與并調(diào)控H5N1病毒引起的JAK-STATl信號通路。 總之,本文揭示了FAT10在H5N1病毒復制過程的重要作用。這一發(fā)現(xiàn)不僅拓寬了我們對這一類泛素蛋白分子生物學功能的理解,更重要的是為針對H5N1病毒的治療藥物研發(fā)提供了新的思路和潛在的靶點。 H5N1病毒引起的免疫細胞和呼吸道上皮細胞死亡,是其重要的致病機制之一。在這一部分論文中主要對FAT10在H5N1病毒引起的細胞死亡中的作用展開了初步的探索。通過MTS實驗檢測細胞活力,我們發(fā)現(xiàn)敲減FAT10能顯著改善A549、BEAS-2B、CNE-2Z細胞中H5N1病毒感染引起的細胞死亡。進一步的研究顯示敲減FAT10能抑制H5N1病毒引起的caspase-3剪切活化,減少H5N1病毒引起凋亡的細胞比例,還能夠抑制促凋亡因子TNFa和FASLG的mRNA表達水平。此外,通過檢測LC3B的蛋白水平我們發(fā)現(xiàn),敲減FAT10不能抑制H5N1病毒誘導的細胞自噬。 因此,我們的結論是FAT10在H5N1病毒引起的呼吸道上皮細胞死亡中起重要作用。敲減FAT10能夠抑制H5N1病毒誘導的細胞凋亡,但不能抑制病毒誘導的細胞自噬。 2009甲型H1N1流感病毒具有強大的傳播能力和較強的致病能力,包含來自豬H1N1流感病毒、人H3N2流感病毒和禽流感病毒的不同片段,其感染及死亡病例主要集中在青壯年,能夠導致急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)等嚴重疾病。通過將我們實驗室篩選到的一株甲流毒株A/Wenshan H1N1病毒感染人鼻咽癌細胞(CNE-2Z)作為模型,我們對FAT10在A/Wenshan H1N1病毒引起的細胞凋亡和病毒復制這兩方面進行了初步研究。研究發(fā)現(xiàn),敲減FAT10能夠抑制A/Wenshan H1N1病毒感染引起的CNE-2Z細胞凋亡。在CNE-2Z細胞中敲減FAT10能夠抑制病毒引起的caspase-3剪切活化,減少病毒感染后發(fā)生凋亡的細胞比例,還能夠抑制促凋亡因子TNFa的表達水平。在CNE-2Z細胞中敲減FAT10能夠抑制A/Wenshan H1N1病毒M1基因的mRNA水平。結合前兩部分的研究,提示我們FAT10可能是流感病毒的一個普遍的宿主因子。
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R373.13

【共引文獻】

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本文編號：2587522