【摘要】：由于缺乏有效的預(yù)防和治療手段,H5N1病毒仍是威脅全球健康的一個(gè)嚴(yán)重的長期隱患。在人感染HSN1病毒的多數(shù)病例中,HSN1病毒能引起嚴(yán)重的臨床癥狀,導(dǎo)致病情快速惡化和病人極高的病死率。許多研究都試圖揭示其毒力增強(qiáng)的遺傳基礎(chǔ)和致病機(jī)理,較強(qiáng)的病毒復(fù)制能力和病毒感染引起的細(xì)胞因子風(fēng)暴被認(rèn)為在其致病機(jī)理中占重要位置。利用高通量組學(xué)研究手段,解析H5N1病毒和宿主細(xì)胞之間的相互作用,找到在H5N1病毒生活周期中起重要作用的宿主因子,將有助于開發(fā)更為廣譜且不易產(chǎn)生耐藥性的治療藥物。 本文研究的主要對(duì)象類泛素蛋白FAT10(又稱泛素D, Ubiquitin D, UBD)即是從H5N1病毒感染小鼠肺組織的基因表達(dá)譜分析中篩選出來的一個(gè)重要宿主因子。我們發(fā)現(xiàn)H5N1病毒的感染在小鼠肺組織和多種人呼吸道上皮細(xì)胞中均能夠引起FAT10表達(dá)水平顯著升高。進(jìn)一步的研究表明,FAT10在H5N1病毒復(fù)制過程中起重要作用。敲減FAT10蛋白能夠抑制H5N1病毒M1基因和NP蛋白的表達(dá)。通過對(duì)FAT10ylation系統(tǒng)重要組分UBA6和USE1的敲減實(shí)驗(yàn)表明,FAT10ylation系統(tǒng)在H5N1病毒復(fù)制中也發(fā)揮重要作用。 通過對(duì)H5N1病毒蛋白及dsRNA類似物poly (IC)的篩選,我們發(fā)現(xiàn)poly (IC)能夠通過RIG-1-p65通路誘導(dǎo)FAT10表達(dá)顯著上調(diào)。在對(duì)FAT10下游作用蛋白的研究中發(fā)現(xiàn),H5N1病毒感染時(shí)p62能夠作為FAT10底物與其結(jié)合。敲減p62后H5N1病毒M1和NP表達(dá)水平顯著升高,說明p62對(duì)H5N1病毒的復(fù)制起限制性作用。HSN1病毒感染后能引起STAT1磷酸化水平升高,而敲減p62能使這一過程中的STAT1磷酸化水平降低,提示p62參與并調(diào)控H5N1病毒引起的JAK-STATl信號(hào)通路。 總之,本文揭示了FAT10在H5N1病毒復(fù)制過程的重要作用。這一發(fā)現(xiàn)不僅拓寬了我們對(duì)這一類泛素蛋白分子生物學(xué)功能的理解,更重要的是為針對(duì)H5N1病毒的治療藥物研發(fā)提供了新的思路和潛在的靶點(diǎn)。 H5N1病毒引起的免疫細(xì)胞和呼吸道上皮細(xì)胞死亡,是其重要的致病機(jī)制之一。在這一部分論文中主要對(duì)FAT10在H5N1病毒引起的細(xì)胞死亡中的作用展開了初步的探索。通過MTS實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力,我們發(fā)現(xiàn)敲減FAT10能顯著改善A549、BEAS-2B、CNE-2Z細(xì)胞中H5N1病毒感染引起的細(xì)胞死亡。進(jìn)一步的研究顯示敲減FAT10能抑制H5N1病毒引起的caspase-3剪切活化,減少H5N1病毒引起凋亡的細(xì)胞比例,還能夠抑制促凋亡因子TNFa和FASLG的mRNA表達(dá)水平。此外,通過檢測LC3B的蛋白水平我們發(fā)現(xiàn),敲減FAT10不能抑制H5N1病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。 因此,我們的結(jié)論是FAT10在H5N1病毒引起的呼吸道上皮細(xì)胞死亡中起重要作用。敲減FAT10能夠抑制H5N1病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,但不能抑制病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。 2009甲型H1N1流感病毒具有強(qiáng)大的傳播能力和較強(qiáng)的致病能力,包含來自豬H1N1流感病毒、人H3N2流感病毒和禽流感病毒的不同片段,其感染及死亡病例主要集中在青壯年,能夠?qū)е录毙院粑狡染C合征(ARDS)等嚴(yán)重疾病。通過將我們實(shí)驗(yàn)室篩選到的一株甲流毒株A/Wenshan H1N1病毒感染人鼻咽癌細(xì)胞(CNE-2Z)作為模型,我們對(duì)FAT10在A/Wenshan H1N1病毒引起的細(xì)胞凋亡和病毒復(fù)制這兩方面進(jìn)行了初步研究。研究發(fā)現(xiàn),敲減FAT10能夠抑制A/Wenshan H1N1病毒感染引起的CNE-2Z細(xì)胞凋亡。在CNE-2Z細(xì)胞中敲減FAT10能夠抑制病毒引起的caspase-3剪切活化,減少病毒感染后發(fā)生凋亡的細(xì)胞比例,還能夠抑制促凋亡因子TNFa的表達(dá)水平。在CNE-2Z細(xì)胞中敲減FAT10能夠抑制A/Wenshan H1N1病毒M1基因的mRNA水平。結(jié)合前兩部分的研究,提示我們FAT10可能是流感病毒的一個(gè)普遍的宿主因子。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R373.13

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2587522