【摘要】： 背景: Ca2+是細(xì)胞內(nèi)最嚴(yán)格的調(diào)節(jié)離子,參與了各種Ca2+結(jié)合蛋白的活動,例如激酶、磷酸酶和蛋白激酶的信號級聯(lián)激活。鈣信號誘導(dǎo)各種生理反應(yīng),參與包括肌肉收縮、囊泡分泌、細(xì)胞分化、增殖和細(xì)胞死亡。不同細(xì)胞對鈣信號的反應(yīng)不同,在同一細(xì)胞中,不同形式的鈣信號可產(chǎn)生不同的反應(yīng)。例如在心肌細(xì)胞,動作電位導(dǎo)致的Ca2+內(nèi)流觸發(fā)細(xì)胞收縮;而在病理生理條件下(如心肌肥大),鈣信號可通過基因表達(dá)激活轉(zhuǎn)錄因子,誘導(dǎo)心肌表型重構(gòu)。此外,鈣信號延長可以導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此,明確不同的鈣信號系統(tǒng)是如何控制不同的細(xì)胞功能對于更好的理解機(jī)體組織中鈣信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)有重要意義。Ca2+作為細(xì)胞信號存在于細(xì)胞外液和胞內(nèi)的儲存庫,前者例如許多胞漿膜通道受到膜去極化、胞外和胞內(nèi)配體、機(jī)械牽拉刺激引起通道開放,后者例如ryanodine受體和IP3受體對從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或者肌漿網(wǎng)釋放的Ca2+產(chǎn)生反應(yīng)。對心肌細(xì)胞來說,離子鈣將細(xì)胞的興奮(即動作電位)與細(xì)胞的收縮聯(lián)系起來,此即為興奮-收縮耦聯(lián)(excitation-contraction coupling, ECC)。在ECC過程中,心肌細(xì)胞的興奮引起胞膜上的電壓依賴性L-型鈣通道開放,胞外Ca2+內(nèi)流,以鈣誘導(dǎo)鈣釋放(Ca2+-induced Ca2+ release, CICR)的方式引起心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)(sarcoplasmic reticulum, SR)在短時間內(nèi)通過其膜上的鈣釋放通道(即ryanodine受體)向胞漿釋放大量的鈣,造成胞漿內(nèi)鈣離子濃度瞬時升高,此即為鈣瞬變(Ca2+ transients)。鈣瞬變通過肌鈣蛋白(troponin)引起細(xì)胞收縮[1]。鈣瞬變是心肌細(xì)胞中最明顯、最強(qiáng)烈和最典型的胞內(nèi)鈣信號變化。通過對鈣瞬變的觀測,可了解心肌細(xì)胞的功能活動特點和狀態(tài)。因此,我們以共聚焦顯微鏡作為記錄方式,通過給予不同的藥物灌流作用于心室肌細(xì)胞,以局部場電刺激的方法誘發(fā)全細(xì)胞的鈣釋放(鈣瞬變),觀察不同的藥物對心室肌細(xì)胞胞內(nèi)鈣信號的影響,并探討其發(fā)生機(jī)制為臨床心血管疾病的防治提供一定的理論依據(jù)。 目的: (1)觀測不同濃度的高鉀灌流液對成年SD大鼠心室肌細(xì)胞胞內(nèi)鈣信號影響,分析圖像數(shù)據(jù)中所包含的信息,探討不同濃度的高鉀灌流液影響心室肌細(xì)胞胞內(nèi)鈣信號可能的機(jī)制; (2)觀測不同濃度的低鉀灌流液對成年SD大鼠心室肌細(xì)胞胞內(nèi)鈣信號影響,分析圖像數(shù)據(jù)中所包含的信息,探討不同濃度的低鉀灌流液影響心室肌細(xì)胞胞內(nèi)鈣信號可能的機(jī)制; (3)觀測不同濃度的鈣通道阻滯劑-硝苯地平灌流液對成年SD大鼠心室肌細(xì)胞胞內(nèi)鈣信號影響,分析圖像數(shù)據(jù)中所包含的信息,探討不同濃度的硝苯地平灌流液影響心室肌細(xì)胞胞內(nèi)鈣信號可能的機(jī)制。 材料與方法: 清潔級成年SD大鼠,雌雄不拘,體重200~350g。采用改進(jìn)的Langendorff裝置,行主動脈插管逆向灌流,以0.6mg/ml膠原酶Ⅱ+ 0.06mg/ml蛋白酶+1mg/ml牛血清白蛋白混合液消化心臟,經(jīng)三次不同濃度含鈣臺氏液復(fù)鈣后得到鈣穩(wěn)態(tài)心肌細(xì)胞。室溫放置1~2小時后將分離好的心肌單細(xì)胞先與鈣熒光指示劑fluo-4-AM(終濃度為15μmol/L)(Molecular probes,Inc)共同孵育15min,棄上清去除細(xì)胞外鈣熒光染料后加入臺氏液。適合進(jìn)行實驗的細(xì)胞必需符合以下標(biāo)準(zhǔn):①橫紋肌清晰;②呈桿狀;③表面干凈平整;④觀察1min無自發(fā)收縮活動。孵育好染料的細(xì)胞置于Zeiss LSM-510 META型共聚焦顯微鏡的載物臺上進(jìn)行觀測。共聚焦顯微鏡鈣成像主要采用快速二維掃描(fast 2-dimension scanning)和線掃描(line scanning)二種方式,通過觸發(fā)連接可使SEN-7203型電子刺激器與LSM-510型共聚焦顯微鏡同步工作得到心肌細(xì)胞的誘發(fā)鈣瞬變圖像。實驗獲得的激光共聚焦顯微鏡圖像采用自編程序處理,編程語言為IDL(interactive data language, research systems, Inc.)鈣瞬變的幅度以標(biāo)準(zhǔn)熒光強(qiáng)度的凈變化△R=△F/F0表示,其中F0為靜息狀態(tài)下fluo-4的背景熒光強(qiáng)度。 結(jié)果: 1.高鉀對心室肌細(xì)胞胞內(nèi)鈣信號的影響:(1)正常細(xì)胞外液時(胞外鉀離子濃度為5.4mmol/L)心肌細(xì)胞在線掃描(line scanning)模式下鈣瞬變峰值為7.56±0.56(單位為△F/F0),給予7.5mmol/LKCl灌流后,心肌細(xì)胞鈣瞬變峰值為7.90±0.63(單位為△F/F0),標(biāo)準(zhǔn)化后比值為1.07±0.03大于1,表明其胞內(nèi)鈣瞬變峰值比正常液強(qiáng)(P0.05);給予10、20、50mmol/L KCl的細(xì)胞外液灌流,心肌細(xì)胞鈣瞬變峰值均較正常液降低,并且隨著細(xì)胞外液KCl濃度增高而逐漸降低(P0.05)。(2)給予不同濃度的高鉀(7.5、10、20、50mmol/L KCl)灌流心室肌細(xì)胞,靜息狀態(tài)下心室肌細(xì)胞胞內(nèi)鈣信號隨著鉀離子濃度的升高而增高(P0.05),在50mmol/L KCl灌流時,心室肌細(xì)胞胞內(nèi)鈣信號強(qiáng)度約為正常液灌流時的3倍,心室肌細(xì)胞胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)處于失衡狀態(tài)。 2.低鉀對心室肌細(xì)胞胞內(nèi)鈣信號的影響:(1)給予2mmol/L KCl的細(xì)胞外液灌流心肌細(xì)胞(共觀察6個細(xì)胞),5個心肌細(xì)胞可正常誘發(fā)鈣瞬變,所誘發(fā)的鈣瞬變峰值(反映鈣釋放的強(qiáng)度)為6.85±0.70與對照組6.54±0.21相比變化不明顯(P0.05);半高寬(反映鈣釋放持續(xù)時間)為203.31±17.12 ms,與對照組176.46±17.08 ms相比,明顯延長(P0.05)。洗去2mmol/L KCl之后誘發(fā)鈣瞬變的峰值為6.25±0.28,與對照組比略有降低,但P0.05;半高寬222.49±17.00 ms,與對照組比,明顯延長(P0.05),這說明2mmol/L低鉀液可延長誘發(fā)鈣瞬變的持續(xù)時間,且此效應(yīng)在短時間內(nèi)不易完全恢復(fù)。另有1個心肌細(xì)胞先有正常誘發(fā)鈣瞬變,后對場刺激不反應(yīng),然后出現(xiàn)自發(fā)鈣瞬變。 (2)給予1mmol/L KCl的細(xì)胞外液灌流心室肌細(xì)胞(共觀察9個細(xì)胞),5個心肌細(xì)胞可正常誘發(fā)鈣瞬變,所誘發(fā)的鈣瞬變峰值(反應(yīng)鈣釋放的強(qiáng)度)雖有增大趨勢,但P0.05;洗去1mmol/L低鉀液之后半高寬為209.0±22.1 ms與對照組178.4±18.8 ms比較明顯延長(P0.05)。1個心肌細(xì)胞先有正常誘發(fā)鈣瞬變(時程延長),后對場刺激無反應(yīng),后出現(xiàn)自發(fā)現(xiàn)象;1個心肌細(xì)胞剛開始對場刺激無反應(yīng),后有正常誘發(fā)鈣瞬變(時程延長),后又無反應(yīng);2個心肌細(xì)胞對場刺激不反應(yīng),只有自發(fā)鈣瞬變。 (3)給予無鉀的細(xì)胞外液灌流心室肌細(xì)胞(共觀察8個細(xì)胞),7個細(xì)胞有自發(fā)現(xiàn)象,洗去無鉀液之后誘發(fā)鈣瞬變恢復(fù),但效應(yīng)時程211.0±9.7 ms較對照組155.4±3.8 ms均延長(P0.05):其中的3個細(xì)胞先有正常誘發(fā)鈣瞬變(時程延長),后出現(xiàn)自發(fā)鈣瞬變或鈣波現(xiàn)象;3個細(xì)胞剛開始無反應(yīng)(對場刺激不反應(yīng)),后產(chǎn)生自發(fā)鈣瞬變或鈣波;1個細(xì)胞自發(fā)鈣瞬變或鈣波(對場刺激不反應(yīng));1個細(xì)胞無自發(fā)反應(yīng),誘發(fā)鈣瞬變在灌流后迅速明顯減弱,后誘發(fā)鈣瞬變強(qiáng)度恢復(fù)到接近正常,但時程明顯延長,細(xì)胞收縮基本消失。 3.不同濃度硝苯地平對心室肌細(xì)胞胞內(nèi)鈣信號的影響:所有濃度水平(2、5、10、50μmol/L)的硝苯地平都可使大鼠心室肌細(xì)胞胞內(nèi)鈣瞬變峰值降低(P0.05),在所檢測的各濃度水平中,5μmol/L硝苯地平標(biāo)準(zhǔn)化值最低,降低胞內(nèi)鈣瞬變峰值的效果比2μmol/L硝苯地平明顯(P0.05)。硝苯地平對靜息狀態(tài)下大鼠心室肌細(xì)胞胞內(nèi)鈣信號的影響則不明顯。 結(jié)論: 1.胞外高鉀液灌流可引起心室肌細(xì)胞胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡,隨著胞外鉀離子濃度的升高,心室肌細(xì)胞胞內(nèi)鈣瞬變峰值先升高后降低;重度鉀離子濃度(10、20、50mmol/L)升高所引起的誘發(fā)鈣瞬變峰值降低與相應(yīng)狀態(tài)下胞內(nèi)靜息鈣水平的升高有密切聯(lián)系。 2.盡管心室肌細(xì)胞不同個體對胞外低鉀的敏感性不同,但總的趨勢是:低鉀可以引起心室肌細(xì)胞胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡。輕度低鉀液灌流引起誘發(fā)鈣瞬變的漸變(峰值不變而鈣釋放時間延長),無鉀液灌流可引起胞內(nèi)鈣信號的突變:出現(xiàn)自發(fā)鈣瞬變或鈣波。 3.硝苯地平可降低心室肌細(xì)胞胞內(nèi)鈣瞬變強(qiáng)度,但是不影響心室肌細(xì)胞胞內(nèi)的靜息鈣水平。
【圖文】：

型電子刺激器與LSM-510型共聚焦顯微鏡同步工作得到心肌細(xì)胞的誘發(fā)鈣瞬變圖(1)快速二維掃描方式：激光共聚焦掃描系統(tǒng)的主要設(shè)置為：單幅二維圖像為 64×32，空間分辨率為 1.80μm/像素；每掃一幅圖的時間為 49.15ms/幅；一般100 至 300 幅二維圖像不等，相鄰兩幅圖像之間的時間間隔為 0 ms。電子刺激器置為：延時 1500ms，波寬為 0.5ms，強(qiáng)度為 20V。在正式開始連續(xù)快速二維掃描行大像素二維掃描（512X512），以獲取細(xì)胞的整體范圍和熒光染料負(fù)載情況，通平面位置選取合適的細(xì)胞層面（熒光分布均勻，且盡量避開細(xì)胞核所在的層面）。(2)線掃描方式：激光共聚焦掃描系統(tǒng)的主要設(shè)置為：掃描線像素數(shù)為512，空率為0.22μm/像素；共掃描1000條線，采樣速率為1.92ms/線。電子刺激器的主要設(shè)延時400ms，波寬為0.5ms，強(qiáng)度為20V。類似地，在放置掃描線之前先采用大像素面掃描方式，以獲得細(xì)胞的整體范圍；通過調(diào)節(jié)焦平面位置選取合適的細(xì)胞層面掃描線約置于細(xì)胞長軸縱向正中切面的中央，，再轉(zhuǎn)換為線掃描方式，并與局部場合（圖1），以記錄胞內(nèi)鈣瞬變和細(xì)胞收縮。

1.6 圖像分析與處理 實驗獲得的激光共聚焦顯微鏡圖像采用自編程序處理，編程語言為IDL（interactive data language, research systems, Inc.）“A1B1B2A2”所包括范圍為靜息區(qū), “B1C1C2B2”所包括范圍為效應(yīng)區(qū)（圖1-2）。鈣瞬變的幅度以標(biāo)準(zhǔn)熒光強(qiáng)度的凈變化△ R= △F/F0表示，其中F0為靜息狀態(tài)下fluo-4的背景熒光強(qiáng)度[13]。圖1-2 激光共聚焦線掃描方式記錄的成年鼠心肌細(xì)胞胞內(nèi)鈣瞬變Fig.1-2 Confocal microscopic line-scanning of adult cardiac Ca2+transients1.7 統(tǒng)計學(xué)方法實驗結(jié)果采用 Microsoft Excel 軟件進(jìn)行分析，如未特別說明，數(shù)據(jù)均以 X ±SEM 表示，統(tǒng)計學(xué)方法為配對 t 檢驗和單因素方差分析（one-way ANOVA），P<0.05 為有統(tǒng)計學(xué)意義。表 1-1，1-2 中的 normalized data 為灌流藥物后的效應(yīng)與相應(yīng)的 control 數(shù)據(jù)（前對照與后對照之和除以 2）的比值。4
【學(xué)位授予單位】：汕頭大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R96;R33

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 任崇余;曹濟(jì)民;;Kv4鉀通道及其相互作用蛋白KChIP2與心律失常[J];國際病理科學(xué)與臨床雜志;2006年02期

2 沈建新,程和平,韓太真;異丙腎上腺素對心肌細(xì)胞內(nèi)鈣釋放和肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣容量的影響[J];心臟雜志;2004年03期

本文編號：2587418