發(fā)布時間：2020-03-12 07:03

【摘要】： 單純皰疹病毒(Herpes simplex virus,HSV)是危害人類健康的常見病原體,其感染發(fā)病率高,且容易導(dǎo)致復(fù)發(fā)性感染和潛伏感染。HSV有1型(HSV1)及2型(HSV2)兩型,HSV1主要引起口面部感染、眼部感染和皰疹性腦炎等;HSV2主要引起生殖器感染,并且和女性宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)。目前國內(nèi)外無HSV疫苗,在積極研制。HSV包膜蛋白在病毒的吸附、入侵和刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答及疫苗研制中具有重要地位,其中g(shù)B蛋白和gD蛋白能誘發(fā)特異性應(yīng)答,具有重要的抗原表位,是宿主細(xì)胞免疫和體液免疫的主要靶標(biāo)之一,因此gB、gD蛋白是構(gòu)建HSV疫苗的理想抗原。本研究分析篩選HSV1 gD、HSV1 gB、HSV2 gD三種蛋白的抗原表位,利用基因工程技術(shù)表達(dá)三種蛋白,為研制重組HSV1型及2型二價疫苗奠定基石出。 通過對HSV1 gB、gD及HSV2 gD三種蛋白的抗原表位分析,篩選三種蛋白含強(qiáng)抗原決定簇較集中的胞外區(qū)片段,選用真核和原核細(xì)胞均偏愛的密碼子,并對設(shè)計(jì)基因的RNA結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化,化學(xué)合成HSV1 gB、HSV1 gD、HSV2 gD含信號肽序列的基因序列。 以化學(xué)合成的HSV1 gB、HSV1 gD、HSV2 gD含信號肽序列的胞外區(qū)基因序列為模板,用PCR方法擴(kuò)增HSV1 gB、HSV1gD、HSV2gD胞外區(qū)1～696aa1l～284aa、1～284aa的基因片段,并將其插入原核表達(dá)載體pGEX-4T-2內(nèi),獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE鑒定分析。表達(dá)的HSV1gB/GST、HSV1 gD/GST、HSV2gD/GST融合蛋白分子量分別為96kd、56kd、56kd。利用親和層析方法,純化獲得可溶性重組HSV1gB、HSV1gD、HSV2gD蛋白。 將純化獲得的融合蛋白HSV1gB/GST倍比稀釋,用Human HSV1ELISA試劑盒檢測表達(dá)蛋白HSV1gB/GST的抗原性。將純化獲得的HSV1gD/GST、HSV2gD/GST融合蛋白倍比稀釋,用HRP標(biāo)記的HSV1+HSV2抗體檢測表達(dá)蛋白HSV1gD/GST、HSV2gD/GST的抗原性。結(jié)果顯示,表達(dá)的三種融合蛋白具有較好的抗原性和特異性。 將純化后的重組表達(dá)蛋白HSV1gD/GST用凝血酶切去GST標(biāo)簽后作為抗原免疫新西蘭白兔,取兔耳緣靜脈血用間接ELISA法檢測抗HSVgD1抗體效價≥1:64 000。表明重組表達(dá)蛋白HSVgD1有良好的免疫反應(yīng)性。 以化學(xué)合成的HSV1gB、HSV1gD、HSV2gD含信號肽序列的胞外區(qū)基因序列為模板,PCR擴(kuò)增HSV1gB、HSV1gD、HSV2gD胞外區(qū)含信號肽序列1～706aa、1-314aa、1-314aa的基因片段,將其插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)內(nèi),用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞,Western Blot分析檢測目的蛋白在胞內(nèi)和胞外的表達(dá)。結(jié)果顯示,表達(dá)的HSV1gD、HSV2gD蛋白在胞內(nèi)及培養(yǎng)上清內(nèi)均存在,而HSV1gB蛋白未表達(dá)。合成HSV1gB蛋白基因不表達(dá)提示,在真核表達(dá)系統(tǒng)中,基因的RNA二級結(jié)構(gòu)比密碼子使用頻率更重要。
【圖文】：

1Hsvl一gB、Hsvl一gn、HsvZ一:oNAmarker(DL2000，幾KaHsVI一gDpCR產(chǎn)物:3:HSVI一gB的構(gòu)建與鑒定構(gòu)建的HSV1gB、HSv1gD、個BamHI酶切位點(diǎn)，3’I與EcoRI對純化的P連接，將連接后的重組轉(zhuǎn)化子。重組質(zhì)粒的構(gòu)建)。

圖2pGEx一4T-ZIHSvl一叨重組質(zhì)粒的構(gòu)建(二)重組質(zhì)粒的篩選與鑒定在LB培養(yǎng)基平板上涂布重組質(zhì)粒菌液，37℃過夜培養(yǎng)，隨機(jī)挑取6個轉(zhuǎn)化子菌落，同時另外挑取1個陰性對照菌(含pGEX一4T-2空質(zhì)粒)，分別接種培養(yǎng)后進(jìn)行如下鑒定分析。1.PCR鑒定以上述轉(zhuǎn)化子為模板擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(設(shè)陽性對照)。HSvlgB一pGEX一4T-2重組質(zhì)拉的6個轉(zhuǎn)化子均擴(kuò)增出目的基因片段(Z107bp)，陰性對照菌未擴(kuò)增出基因片段。其中2、3、4號條帶較亮，l、5、6號條帶較淡(圖3)。Hsvl叨一p伍x一4不2重組質(zhì)粒的6個轉(zhuǎn)化子均擴(kuò)增出目的基因片段(873飾)，陰性對照菌未擴(kuò)增出基因片段。其中1、5號條帶較亮，2、3、4、6號條帶較淡
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前9條

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本文編號：2586489