發(fā)布時(shí)間：2020-03-12 04:21

【摘要】： 目的腫瘤細(xì)胞由于表面缺乏共刺激分子的表達(dá),無(wú)法起始有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答,4-1BBL作為一種重要的共刺激分子,在腫瘤免疫中的作用越來(lái)越受到重視,為了充分研究4-1BBL在腫瘤免疫中的作用,我們構(gòu)建了人4-1BBL真核表達(dá)載體pEGFP-4-1BBL并轉(zhuǎn)染口腔鱗癌細(xì)胞株,在體外與健康人外周血T淋巴細(xì)胞共同孵育,檢測(cè)其在體外腫瘤免疫中的作用。探索建立人口腔鱗癌PBL-SCID鼠嵌合模型,進(jìn)一步評(píng)價(jià)4-1BBL在人口腔鱗癌PBL-SCID鼠嵌合模型腫瘤免疫中的作用。 方法(1)構(gòu)建并鑒定真核表達(dá)載體pEGFP-4-1BBL,脂質(zhì)體法將重組載體pEGFP-4-1BBL轉(zhuǎn)染入人口腔鱗癌細(xì)胞Tca8113中,經(jīng)G418(400μg/ml)篩選及有限稀釋法后獲得穩(wěn)定高表達(dá)克隆,分別用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和蛋白質(zhì)印跡法(western blot)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中h4-1BBLmRNA和蛋白的表達(dá)。通過(guò)絲裂霉素處理制備腫瘤細(xì)胞瘤苗。經(jīng)體外與人外周血T淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)后,測(cè)定淋巴細(xì)胞特異性殺傷活性,T細(xì)胞增殖水平,T細(xì)胞分型及對(duì)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子白介素-2(IL-2)、干擾素-γ(IFN-γ)的影響。(2)SCID鼠右背部皮下注射5×10~5(0.2ml)Tca8113細(xì)胞。成瘤后隨機(jī)分成4組,尾靜脈注射anti-asialo-GM1多抗,其中第③組瘤內(nèi)注射腺病毒空載體、第④組瘤內(nèi)注射載有4-1BBL基因的腺病毒,隨后②③④組小鼠腹腔注射健康志愿者外周血淋巴細(xì)胞(huPBL)3×10~7(0.5ml),第①組腹腔注射0.5ml1640培養(yǎng)基。每周記錄各組小鼠成瘤情況,免疫重建后第2、7周取鼠血用ELISA法測(cè)定人IgG含量。小鼠處死后比較各組小鼠體重及腫瘤、脾臟的重量。RT-PCR檢測(cè)4-1BBL基因在瘤體內(nèi)的表達(dá),HE染色觀察腫瘤及脾臟生長(zhǎng)情況。 結(jié)果(1)RT-PCR及Western blot檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因Tca8113細(xì)胞中4-1BBL的表達(dá)轉(zhuǎn)染空載體pEGFP的Tca8113細(xì)胞中,沒(méi)有檢測(cè)到4-1BBL的表達(dá)。經(jīng)過(guò)G418篩選后有限稀釋法建立了4-1BBL/Tca8113細(xì)胞株。經(jīng)MMC處理后,與未轉(zhuǎn)染的Tca8113細(xì)胞相比較,轉(zhuǎn)染人4-1BBL的Tca8113細(xì)胞能夠顯著增強(qiáng)T細(xì)胞增殖,促進(jìn)IL-2、IFN-γ分泌,并能有效地誘導(dǎo)CTL產(chǎn)生對(duì)Tca8113細(xì)胞的特異性殺傷作用。(2)模型成瘤率為100%,成瘤潛伏期12～18天。免疫重建后第2、7周時(shí)人口腔癌PBL-SCID嵌合組小鼠血中人IgG分別達(dá)(71.8±13.2)μg/ml、(136.9±15.3)μg/ml。免疫重建及轉(zhuǎn)染4-1BBL基因組小鼠,腫瘤生長(zhǎng)受到明顯抑制(p＜0.01)。冰凍切片在倒置熒光顯微鏡下圖像及RT-PCR證明4-1BBL基因在瘤體內(nèi)充分表達(dá),冰凍切片HE染色見(jiàn)腫瘤生長(zhǎng)、脾臟有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。 結(jié)論轉(zhuǎn)染4-1BBL基因既能增強(qiáng)口腔鱗癌細(xì)胞Tca8113的免疫原性,亦能誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答。SCID小鼠皮下注射口腔鱗癌細(xì)胞、尾靜脈注射anti-asialo-GM1多抗及腹腔注射人淋巴細(xì)胞可建立人口腔鱗癌PBL-SCID嵌合模型,經(jīng)腺病毒轉(zhuǎn)染4-1BL基因后,可顯著提高宿主對(duì)瘤體的抑制作用。
【學(xué)位授予單位】：汕頭大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類(lèi)號(hào)】：R392;R739.8

【參考文獻(xiàn)】

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1 崔恒,李藝,童春容,成夜霞,馮捷,劉蓓,葛華,錢(qián)和年;免疫重建荷人卵巢-癌嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠模型的建立[J];北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2000年06期

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本文編號(hào)：2586451