【摘要】： [目的] 1、構(gòu)建體外血管生成的三維培養(yǎng)模型,研究體內(nèi)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HVUECs)、體外培養(yǎng)的HVUECs和體外三維培養(yǎng)的血管樣結(jié)構(gòu)中促血管生成素1、2及其受體(Ang1、2及Tie2)的表達水平,旨在探討其在體外血管生成中的作用。 2、探討應用RNA干擾(RNAi)技術(shù)沉默Ang2、Tie2基因使其在體外抑制血管生成的研究,為將來進一步進行抑制腫瘤血管生成的動物實驗研究奠定基礎,為腫瘤的基因治療提供實驗依據(jù)。 [方法] 1、以酶消化法獲得HVUECs,經(jīng)免疫細胞化學染色技術(shù)鑒定,采用夾心培養(yǎng)法構(gòu)建體外血管生成的三維培養(yǎng)模型,獲得三維血管樣結(jié)構(gòu)。 2、采用逆轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈式反應(RT-PCR)的方法、免疫組化法和免疫細胞化學染色法分別檢測10例體內(nèi)HVUECs、體外培養(yǎng)的HVUECs及體外三維培養(yǎng)模型的血管樣結(jié)構(gòu)中Ang1、Ang2及Tie2的mRNA和蛋白的表達水平。 3、以Ang2、Tie2的mRNA已知序列為靶點,構(gòu)建pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2.siRNA重組質(zhì)粒各2條。 4、pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重組質(zhì)粒通過脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染HUVECs,采用免疫細胞化學染色和RT-PCR檢測各組HUVECs中Ang2和Tie2的mRNA及蛋白的表達狀況。 5、應用體外血管生成的三維培養(yǎng)模型研究pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的HUVECs在體外形成血管樣結(jié)構(gòu)的情況。 [結(jié)果] 1、以酶消化法可獲得以HVUECs為主的混合細胞懸液,經(jīng)反復貼壁法分離純化內(nèi)皮細胞,采用免疫細胞化學染色技術(shù)對內(nèi)皮細胞進行鑒定并確定了所純化的細胞為HVUECs。采用夾心培養(yǎng)法成功構(gòu)建了體外血管生成的三維培養(yǎng)模型,獲得三維血管樣結(jié)構(gòu)。 2、體外三維培養(yǎng)模型中Ang2、Tie2的蛋白及mRNA表達水平均高于體內(nèi)和體外培養(yǎng)組(P＜0.05);體內(nèi)和體外培養(yǎng)組之問Ang2、Tie2的蛋白及mRNA表達水平相比差異無顯著性意義(P＞0.05)。 3、體內(nèi)、體外培養(yǎng)及體外三維培養(yǎng)模型中Ang1的蛋白及mRNA表達水平相比差異無顯著性意義(P＞0.05)。 4、成功構(gòu)建pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重組質(zhì)粒各2條,并且應用限制性內(nèi)切酶HindⅢ進行消化,證實重組質(zhì)粒不能被消化;測序結(jié)果與設計的完全相符。 5、pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUVECs后,免疫細胞化學染色和RT-PCR檢測結(jié)果顯示,Ang2及Tie2在蛋白和mRNA的表達水平均受到明顯抑制(P＜0.05),并且兩個siRNA的2條重組質(zhì)粒之間均無明顯差別(P＞0.05)。 6、pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的HUVECs在體外三維培養(yǎng)模型中血管樣結(jié)構(gòu)形成的數(shù)量和長度均明顯減少(P＜0.05),表明血管生成受到明顯抑制。 [結(jié)論] 1、夾心培養(yǎng)法是較為成熟的體外血管生成的三維培養(yǎng)方法,具有操作簡便、三維血管樣結(jié)構(gòu)形成數(shù)量多、網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)復雜等特點,適用于體外血管生成影響因素的實驗研究。 2、Ang2、Tie2在體內(nèi)和體外培養(yǎng)的HUVECs及體外三維培養(yǎng)模型的血管樣結(jié)構(gòu)中均有陽性表達,而Ang2、Tie2在三維培養(yǎng)模型中表達明顯上調(diào),表明Ang/Tie2體系在體外血管生成中起重要的作用。 3、成功構(gòu)建pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重組質(zhì)粒。 4、Ang2-siRNA、Tie2-siRNA在體外能夠抑制HUVECs的Ang2和Tie2的蛋白及mRNA的表達,從而在體外抑制血管生成。
【圖文】：

圖3HI少壓CsHE染色細胞涂片中內(nèi)皮細胞呈圓形，胞核及核仁清晰可見(HE，HUVECs免疫化學染色鑒定結(jié)果分離純化獲得的翻叭咫Cs，經(jīng)CD31、CD34、第姍因子染色顯示，在漿有棕黃色顆粒沉著，三者在內(nèi)皮細胞均為陽性表達(圖4、5、6)。

HUVECs在4小時左右開始貼壁，形成單層多細胞集落，細胞呈梭形(圖l);伴隨細胞迅速生長，集落增大初長出的細胞為梭形，，一般5天左右融合成片，細胞互不重疊，呈單層鋪路石狀鑲嵌排列，此時細胞呈多角形、梭形或卵圓形(圖2);HE染色時，密集區(qū)細胞核呈橢圓形，染淡藍色，密集區(qū)邊緣和稀疏區(qū)的梭形細胞胞核呈梭形，著色深，呈紫藍色(圖3)。圖l原代培養(yǎng)的扣盯壓Cs在4小時左右開始貼壁，形成單層多細胞集落，細胞呈梭形 (x100)
【學位授予單位】：昆明醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R346

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1 林菊麗;pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其對體外血管生成的作用[D];福建醫(yī)科大學;2009年

本文編號：2586162