【摘要】： [目的] 1、構建體外血管生成的三維培養(yǎng)模型,研究體內人臍靜脈內皮細胞(HVUECs)、體外培養(yǎng)的HVUECs和體外三維培養(yǎng)的血管樣結構中促血管生成素1、2及其受體(Ang1、2及Tie2)的表達水平,旨在探討其在體外血管生成中的作用。 2、探討應用RNA干擾(RNAi)技術沉默Ang2、Tie2基因使其在體外抑制血管生成的研究,為將來進一步進行抑制腫瘤血管生成的動物實驗研究奠定基礎,為腫瘤的基因治療提供實驗依據(jù)。 [方法] 1、以酶消化法獲得HVUECs,經免疫細胞化學染色技術鑒定,采用夾心培養(yǎng)法構建體外血管生成的三維培養(yǎng)模型,獲得三維血管樣結構。 2、采用逆轉錄.聚合酶鏈式反應(RT-PCR)的方法、免疫組化法和免疫細胞化學染色法分別檢測10例體內HVUECs、體外培養(yǎng)的HVUECs及體外三維培養(yǎng)模型的血管樣結構中Ang1、Ang2及Tie2的mRNA和蛋白的表達水平。 3、以Ang2、Tie2的mRNA已知序列為靶點,構建pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2.siRNA重組質粒各2條。 4、pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重組質粒通過脂質體介導轉染HUVECs,采用免疫細胞化學染色和RT-PCR檢測各組HUVECs中Ang2和Tie2的mRNA及蛋白的表達狀況。 5、應用體外血管生成的三維培養(yǎng)模型研究pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重組質粒轉染后的HUVECs在體外形成血管樣結構的情況。 [結果] 1、以酶消化法可獲得以HVUECs為主的混合細胞懸液,經反復貼壁法分離純化內皮細胞,采用免疫細胞化學染色技術對內皮細胞進行鑒定并確定了所純化的細胞為HVUECs。采用夾心培養(yǎng)法成功構建了體外血管生成的三維培養(yǎng)模型,獲得三維血管樣結構。 2、體外三維培養(yǎng)模型中Ang2、Tie2的蛋白及mRNA表達水平均高于體內和體外培養(yǎng)組(P＜0.05);體內和體外培養(yǎng)組之問Ang2、Tie2的蛋白及mRNA表達水平相比差異無顯著性意義(P＞0.05)。 3、體內、體外培養(yǎng)及體外三維培養(yǎng)模型中Ang1的蛋白及mRNA表達水平相比差異無顯著性意義(P＞0.05)。 4、成功構建pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重組質粒各2條,并且應用限制性內切酶HindⅢ進行消化,證實重組質粒不能被消化;測序結果與設計的完全相符。 5、pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重組質粒轉染HUVECs后,免疫細胞化學染色和RT-PCR檢測結果顯示,Ang2及Tie2在蛋白和mRNA的表達水平均受到明顯抑制(P＜0.05),并且兩個siRNA的2條重組質粒之間均無明顯差別(P＞0.05)。 6、pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重組質粒轉染后的HUVECs在體外三維培養(yǎng)模型中血管樣結構形成的數(shù)量和長度均明顯減少(P＜0.05),表明血管生成受到明顯抑制。 [結論] 1、夾心培養(yǎng)法是較為成熟的體外血管生成的三維培養(yǎng)方法,具有操作簡便、三維血管樣結構形成數(shù)量多、網(wǎng)絡結構復雜等特點,適用于體外血管生成影響因素的實驗研究。 2、Ang2、Tie2在體內和體外培養(yǎng)的HUVECs及體外三維培養(yǎng)模型的血管樣結構中均有陽性表達,而Ang2、Tie2在三維培養(yǎng)模型中表達明顯上調,表明Ang/Tie2體系在體外血管生成中起重要的作用。 3、成功構建pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重組質粒。 4、Ang2-siRNA、Tie2-siRNA在體外能夠抑制HUVECs的Ang2和Tie2的蛋白及mRNA的表達,從而在體外抑制血管生成。
【圖文】：

圖3HI少壓CsHE染色細胞涂片中內皮細胞呈圓形，胞核及核仁清晰可見(HE，HUVECs免疫化學染色鑒定結果分離純化獲得的翻叭咫Cs，經CD31、CD34、第姍因子染色顯示，在漿有棕黃色顆粒沉著，三者在內皮細胞均為陽性表達(圖4、5、6)。

HUVECs在4小時左右開始貼壁，形成單層多細胞集落，細胞呈梭形(圖l);伴隨細胞迅速生長，集落增大初長出的細胞為梭形，，一般5天左右融合成片，細胞互不重疊，呈單層鋪路石狀鑲嵌排列，此時細胞呈多角形、梭形或卵圓形(圖2);HE染色時，密集區(qū)細胞核呈橢圓形，染淡藍色，密集區(qū)邊緣和稀疏區(qū)的梭形細胞胞核呈梭形，著色深，呈紫藍色(圖3)。圖l原代培養(yǎng)的扣盯壓Cs在4小時左右開始貼壁，形成單層多細胞集落，細胞呈梭形 (x100)
【學位授予單位】：昆明醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R346

【相似文獻】

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1 王彪;RNAi技術沉默Ang2、Tie2基因抑制血管生成的體外實驗研究[D];昆明醫(yī)學院;2008年

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1 林菊麗;pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重組質粒的構建及其對體外血管生成的作用[D];福建醫(yī)科大學;2009年

本文編號：2586162