【摘要】： 研究背景： 腸道病毒71型(Entero virus 71, EV71)感染可以導(dǎo)致手足口病、皰疹性咽峽炎、無菌性腦脊髓膜炎等多種疾病,并可引起嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥或致死性肺水腫。自1969年首次報道以來,EV71已經(jīng)在世界范圍內(nèi)引起了十多次暴發(fā)流行,包括澳大利亞、東南亞和歐洲。眾多血清型的腸道病毒在生物表現(xiàn)型與分子構(gòu)成中具有相同的特性,因此其是否存在共同抗原及其位點存在于何處,已引起國內(nèi)外眾多的關(guān)注。衣殼蛋白在病毒感染及誘導(dǎo)機體免疫反應(yīng)中起重要作用,國內(nèi)外有許多研究致力于EV71衣殼蛋白及其抗體在基因分型和疫苗研制方面的應(yīng)用。 研究目的： 制備能敏感且特異地識別EV71衣殼蛋白VP2的單克隆抗體,為今后臨床檢測EV71提供物質(zhì)基礎(chǔ),并為EV71疫苗的制備及基礎(chǔ)研究提供有力保障。實驗方法： 以GenBank公布的EV71 VP2序列和參考文獻(xiàn)為基礎(chǔ),利用計算機輔助設(shè)計,確定并人工合成抗原多肽,并用Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH)交聯(lián)以增強多肽的免疫原性。用合成的EV71衣殼蛋白VP2抗原多肽免疫BALB/c小鼠,采用雜交瘤融合技術(shù)和有限稀釋法制備抗EV71 VP2單克隆抗體。將篩選獲得的單抗細(xì)胞株注射BALB/c小鼠腹腔,收獲腹水大量制備單抗,用親和純化法純化抗體。采用ELISA法、免疫細(xì)胞化學(xué)染色法、免疫印跡Western-blot和免疫沉淀法(IP)鑒定單克隆抗體的效價、反應(yīng)特異性和敏感性。 實驗結(jié)果： 采用雜交瘤技術(shù),獲得4株針對人工合成的EV71衣殼蛋白VP2抗原多肽的特異性單克隆抗體。抗體亞類鑒定為IgGl型；用ELISA測定制備的單抗效價,純化的單抗效價在1×105-1×106之間；免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定結(jié)果顯示制備的單克隆抗體能夠與EV71衣殼蛋白特異性地結(jié)合。以EV71病毒臨床分離株為抗原,與純化的單克隆抗體進(jìn)行Western-blot和免疫沉淀分析顯示,抗EV71衣殼蛋白VP2單克隆抗體與EV71臨床分離株的制備蛋白反應(yīng)后在相對分子質(zhì)量約40KD處出現(xiàn)1條清晰條帶,說明所制備的單克隆抗體可識別含有抗原肽靶位的EV71,證明制備的單抗具有良好的特異性。 結(jié)論： 本研究制備的抗EV71衣殼蛋白VP2單克隆抗體能敏感且特異地識別EV71衣殼蛋白。該抗體在今后EV71感染的診斷、治療、疫苗制備、病毒的結(jié)構(gòu)功能研究以及抗體分析等方面具有良好的應(yīng)用前景。
【圖文】：

生長至培養(yǎng)孔形成小的細(xì)胞集落。融合后第14天，細(xì)胞克隆迅速增大，，待克隆1/3面積時，可對所有克隆生長孔的培養(yǎng)上清進(jìn)行檢測(圖3.1)。雜交瘤細(xì)胞克隆(第ro天)雜交瘤細(xì)胞克隆(第14天)圖3.1融合后雜交瘤細(xì)胞生長狀況(4x物鏡觀察)3.2雜交瘤細(xì)胞株建立以合成的 EV71VPZ抗原多膚免疫BALB/c小鼠，經(jīng)融合后，共接種708孔，鏡檢長有雜交瘤的有398孔，雜交瘤形成率為56%。經(jīng)ELISA篩選，從398孔中篩選到抗體分泌陽性孔124孔，對抗體分泌陽性孔進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。經(jīng)過四次有限稀釋后獲得四株雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為 0601DZ、060lH4、0601Aro和 0601B11，經(jīng)ELISA鑒定每株的抗體陽性率均達(dá)到100%。圖3.2為060lD2株第四次有限稀釋的ELISA結(jié)果。

文體效價及亞類鑒定Ig亞類測定，結(jié)果如下(見表3.1)抗效價在lx1o，一lxl護之間。3.14株雜交瘤細(xì)胞純化后單克隆純化后抗體效價(lm歲mlxl05lxlO6lxl06lxl06
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R392

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