【摘要】：Epstein-Barr病毒（EBV）可引發(fā)多種疾病，鼻咽癌是其中之一，該病主要存在于東南亞地區(qū)，中國的發(fā)病率占世界的80%。目前，放療和化療是治療鼻咽癌的主要方法，鼻咽癌尤其是中晚期鼻咽癌治療失敗多是由于局部復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移的原因，治療后遠處轉(zhuǎn)移發(fā)生率約22%～36%。鼻咽癌細胞中EBV抗原的存在為免疫治療提供了靶位，在鼻咽癌細胞中僅表達EBV核抗原1（EBNA1）、潛伏膜蛋白1（LMP1）、潛伏膜蛋白2（LMP2）三種病毒蛋白。其中，LMP2具有無致癌性、不引起B(yǎng)淋巴細胞的轉(zhuǎn)化、具有潛在的HLA限制性細胞激活表位、能良好地誘導(dǎo)CTL、以及可以在鼻咽癌細胞中持續(xù)表達等優(yōu)點，因此，LMP2是誘導(dǎo)特異性CTL、預(yù)防和治療NPC的良好靶抗原。 痘苗病毒具有宿主范圍廣、插入外源基因片段長、多種途徑進行接種、易于增殖生產(chǎn)等優(yōu)點。改良型痘苗病毒株（MVA）是痘苗病毒安卡拉株經(jīng)連續(xù)多次傳代后獲得的高度減毒復(fù)制缺陷型痘苗病毒株。其基因組發(fā)生了大量的缺失和突變，導(dǎo)致多個與宿主范圍和致病性相關(guān)的基因功能的喪失。其除了具有痘苗病毒的一些特點以外，還具有安全性高、免疫原性好等優(yōu)點，被廣泛地應(yīng)用到疫苗研究中。 由于病毒載體能產(chǎn)生很強的針對載體自身的中和抗體，限制了同一載體的反復(fù)使用。因此，曾毅院士提出了多載體序貫疫苗免疫策略。研究表明，序貫疫苗免疫能夠很好地誘導(dǎo)特異性CTL免疫應(yīng)答。 本論文以MVA作載體，成功構(gòu)建了重組痘苗病毒MVA-LMP2，該病毒是復(fù)制缺陷型病毒。通過PCR、酶切鑒定及測序分析證明，大小相同，序列正確的LMP2基因準(zhǔn)確插入到MVA載體中。RT-PCR、間接免疫熒光以及Western-Blot法檢測結(jié)果表明，LMP2蛋白能夠有效表達。本文重點評價了MVA-LMP2重組病毒在Balb/c小鼠體內(nèi)所誘導(dǎo)的特異性CTL免疫應(yīng)答水平。以肌肉注射的方法采用低（2×105pfu/只）、中（2×106pfu/只）、高（2×107pfu/只）三個不同劑量組，分別于0、2周免疫Balb/c小鼠，第3周用ELISPOT方法檢測小鼠脾淋巴細胞中EBV-LMP2特異性CTL免疫應(yīng)答水平。結(jié)果表明，三個劑量組的小鼠體內(nèi)都可以產(chǎn)生針對LMP2的特異性細胞應(yīng)答，隨著免疫劑量的增加，所誘導(dǎo)的針對LMP2特異性細胞免疫應(yīng)答增強。MVA-LMP2重組病毒高劑量免疫小鼠經(jīng)LMP2多肽刺激后釋放細胞因子IFN-γ的細胞最高可達437個/106脾淋巴細胞。間接免疫熒光檢測MVA-LMP2免疫小鼠血清中抗LMP2特異性抗體。結(jié)果顯示，MVA-LMP2可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗LMP2抗體。 另外，將本科室已構(gòu)建的DNA疫苗pVR-LMP2、腺病毒疫苗Ad5-LMP2、Ad5f35-LMP2與本課題組構(gòu)建成功的重組痘苗病毒MVA-LMP2組成序貫疫苗，即DNA疫苗pVR-LMP2與腺病毒疫苗Ad5-LMP2兩種載體組成的序貫疫苗；DNA疫苗pVR-LMP2、腺病毒疫苗Ad5-LMP2以及Ad5f35-LMP2三種載體組成的序貫疫苗；DNA疫苗pVR-LMP2、腺病毒疫苗Ad5-LMP2與重組痘苗病毒MVA-LMP2所組成的序貫疫苗。免疫Balb/c小鼠，DNA疫苗免疫兩次，腺病毒疫苗免疫兩次，最后分別用Ad5-LMP2，Ad5f35-LMP2，MVA-LMP2加強免疫一次，末次免疫一周后取脾臟淋巴細胞，ELISPOT檢測特異CTL水平。研究結(jié)果表明，Ad5f35-LMP2免疫組誘導(dǎo)的特異性CTL應(yīng)答反應(yīng)高于Ad5-LMP2免疫組，MVA-LMP2免疫組誘導(dǎo)的特異性CTL應(yīng)答反應(yīng)與前兩者相比，免疫效果最好。經(jīng)LMP2多肽刺激后，1×106個脾淋巴細胞可以釋放細胞因子IFN-γ的細胞最高可達2694個。由此可見，DNA疫苗、腺病毒疫苗以及重組痘苗病毒疫苗所組成的序貫疫苗所誘導(dǎo)的特異性CTL的細胞應(yīng)答效果最佳。
【圖文】：

建了含有 EBV-LMP2 重組痘苗病毒 MVA-LMP2。整三步：首先是 MVA-LacZ 重組病毒的包裝，其次是 n建，最后是 MVA-LMP2 重組病毒的獲得。cZ 重組病毒的構(gòu)建11 轉(zhuǎn)染已感染了 MVA 病毒的 CEF 細胞后，，病毒基因K 區(qū)發(fā)生同源重組。獲得重組痘苗病毒 MVA-LacZ。因，則會出現(xiàn)藍色噬斑，否則為白色。圖 A 為 MV在 X-gal 存在的情況下出現(xiàn)藍色噬斑，圖 B 為 MVA的條件下，沒有出現(xiàn)藍色噬斑。與預(yù)期結(jié)果相一致，毒。重組過程如圖 2-1 所示。

圖 A. MVA-LacZ 圖 B. MVA 對照圖 2-2 MVA-LacZ 病毒感染 CEF 細胞出現(xiàn)的病變Figure 2-2 detection analysis of CEF cells infected by recombinant virus of MVA-LacZ 穿梭質(zhì)粒 pZL-1-LMP2 的構(gòu)建及鑒定.1 neo 基因篩選系統(tǒng) pZL-1 的構(gòu)建 質(zhì)粒 pSC11 去掉 lacZ 基因，并在此位大小約 800 bp 的 neo 基因。同時在啟動子 p7.5 和 p11 之間插入大小約 190K 序列。如圖 2-3 所示。pSC11ΔLacZ4813 bpAmpp7.5P11TKRTKLNeoTKL去除 LacZ 基因插入 neo 基因，TK 序列TKL
【學(xué)位授予單位】：北京工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：2585322