【摘要】： 異基因造血干細(xì)胞移植(allo-HSCT)在臨床中應(yīng)用于對多種惡性血液病的治療,同時對部分實(shí)體瘤、遺傳代謝性疾病及自身免疫性疾病等疾患有顯著療效,但受多種因素的影響,不同個體allo-HSCT術(shù)后療效迥異。移植供受者間主要組織相容性復(fù)合體(MHC,人類又稱為HLA)的錯配所引發(fā)的急重度移植物抗宿主病(GVHD)是影響allo-HSCT預(yù)后的最關(guān)鍵因素之一。2008年美國國家骨髓庫(NMDP)制訂的allo-HSCT配型手冊提出:HLA-A、-B、-Cw、-DRBl四個位點(diǎn)8/8高分辨匹配是allo-HSCT供者選擇的最佳標(biāo)準(zhǔn);無全相合供者時,建議接受HLA-A,-B,-Cw,-DRB1位點(diǎn)中有一個等位基因錯配的供者。但對于何種HLA錯配是具有相容性的或何種HLA錯配不引發(fā)急重度GVHD這一問題目前仍沒有明確答案。因此,隨著HLA不全相合allo-HSCT移植病例的增多,如何評估任意兩個不同HLA分子的相容性程度就成為臨床移植免疫學(xué)與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究都非常關(guān)注和亟待解決的關(guān)鍵問題。 無法判斷不完全相合供受者間HLA相容程度時,人們用HLA的功能匹配、序列匹配、結(jié)構(gòu)匹配等評價方式來進(jìn)行相容性評估。傳統(tǒng)的混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)(MLC)及群體反應(yīng)性T細(xì)胞(PRT)試驗等都依賴體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗,結(jié)果不穩(wěn)定且不適于高通量供者篩選,不能評估所有HLA分子間的相容性。目前亦有根據(jù)HLA氨基酸序列分析其功能差異的理論,及根據(jù)HLA-Pep-TCR復(fù)合體間的結(jié)合能來分析HLA相似性的報道,遺憾的是這些理論假設(shè)大都缺乏臨床數(shù)據(jù)支持而遭到質(zhì)疑。 針對上述現(xiàn)狀,本課題根據(jù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定其功能的理論基礎(chǔ),提出基于HLA分子空間結(jié)構(gòu)差異優(yōu)化選擇allo-HSCT最佳供者的設(shè)想并進(jìn)行了如下研究。 鑒于MHC極具多態(tài)性、連鎖不平衡性及地區(qū)民族差異性,我們首先研究了本地區(qū)、本民族的HLA基因遺傳特征。我們統(tǒng)計了1014例漢族人群HLA-I、-II類經(jīng)典基因座位的基因頻率及單倍型頻率,并分析了HLA基因的連鎖不平衡、人群及地區(qū)分布等群體遺傳學(xué)特征。結(jié)果顯示:漢族人群中較為常見的HLA-I、-II類基因有A*02(0.33),B*15(0.14),Cw*03(0.25),DRB1*15(0.170),DQB1*06(0.218)等。HLA-I類基因較為常見的單倍型是A*02-B*46(0.071),A*02-Cw*01 (0.084),B*46-Cw*01 (0.095)等,并且部分單倍型還呈現(xiàn)出顯著的連鎖不平衡。HLA-II類基因較為常見的單倍型有DRB1*15-DQB1*06-DRB5(0.137)、DRB1*09-DQB1*03 -DRB4(0.129)等,HLA-II類基因單倍型大都高度連鎖,但單倍型種類遠(yuǎn)少于HLA-I類基因。漢族人群與世界其它人種間的HLA基因頻率分布存在差異顯著,且不同地區(qū)的漢族人群HLA基因頻率分布亦差異顯著。這些資料較系統(tǒng)地分析了我國漢族人群的HLA基因分布特征,為后續(xù)有重點(diǎn)的分析HLA分子空間結(jié)構(gòu)差異與GVHD的關(guān)系等研究提供了可靠的遺傳學(xué)資料。 在獲得漢族人群HLA-I、-II類基因多態(tài)性分布的基礎(chǔ)上,我們從HLA分子空間結(jié)構(gòu)差異的角度研究HLA結(jié)構(gòu)與功能相容性。首先用SWISS-MODEL服務(wù)器對IMGT/HLA 2010年1月之前公布的HLA-A、-B、-Cw、-DRB1、-DPB1、-DQB1位點(diǎn)4556個HLA分子逐一構(gòu)建其空間結(jié)構(gòu);隨后用計算機(jī)軟件VMD計算各位點(diǎn)HLA分子兩兩間整體均方根偏差(RMSD),以此衡量HLA分子間空間結(jié)構(gòu)差異的大小;并根據(jù)HLA分子結(jié)構(gòu)特征,剔除非功能結(jié)構(gòu)區(qū)域氨基酸殘基差異對計算結(jié)果的影響,計算修正后分子間均方根偏差(RMSD-revised)。整理匯總160余萬條數(shù)據(jù)后,我們編制了數(shù)據(jù)庫管理工具,即人類白細(xì)胞抗原三維結(jié)構(gòu)匹配打分系統(tǒng)-HLAStrucmark (v1.0),并于2007年獲得國家計算機(jī)軟件著作權(quán)登記證書。該打分系統(tǒng)不僅涵蓋所有HLA分子間結(jié)構(gòu)差異數(shù)據(jù),而且融入了HLA序列比對功能及氨基酸殘基特征展示功能,為HLA分子間結(jié)構(gòu)與功能差異的分析提供了豐富、翔實(shí)和直觀的數(shù)據(jù)。 隨后我們結(jié)合16例HLA不完全相合的臨床HSCT資料進(jìn)行分析,結(jié)果顯示:RMSD或RMSD-revised值均同移植后排斥反應(yīng)強(qiáng)度呈正相關(guān);也就是說,供受者間錯配抗原的結(jié)構(gòu)差異較大,移植后將發(fā)生較為強(qiáng)烈的移植排斥反應(yīng);反之,錯配抗原結(jié)構(gòu)差異較小,移植排斥反應(yīng)程度則較為輕微。但受限于現(xiàn)有臨床病例數(shù)量,如果要獲得可靠結(jié)論還需更大樣本資料來進(jìn)行回顧性分析。 為進(jìn)一步從分子生物學(xué)角度研究HLA分子空間結(jié)構(gòu)差異大小與GVHD發(fā)生程度的聯(lián)系,我們用CTL細(xì)胞的交叉識別格局來評價不同HLA分子間的相容性。我們成功設(shè)計并構(gòu)建了中國漢族人群中常見的HLA-B*1502、HLA-B*1518、HLA-B*3503及HLA-B*4403分子重鏈的真核表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)染入HLA-I類分子缺陷性細(xì)胞株Hmy2.CIR。用轉(zhuǎn)染后的Hmy2.CIR細(xì)胞分別體外負(fù)載低親合力結(jié)合的EBNA肽,誘導(dǎo)活化T細(xì)胞使其成為具有相對抗原特異性的CTL。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,刺激后CD8+T細(xì)胞亞群較誘導(dǎo)前顯著增多,誘導(dǎo)前CD8+/CD4+比值為4:10,而經(jīng)誘導(dǎo)后該比例倒置為10:7;TCR Vβ基因掃描顯示,T細(xì)胞誘導(dǎo)前TCR Vβ各亞群呈典型高斯分布,誘導(dǎo)后T細(xì)胞有明顯單克隆化形成。這說明經(jīng)過低親和力結(jié)合的HLA-EBNA肽復(fù)合體誘導(dǎo),體外培養(yǎng)的T細(xì)胞出現(xiàn)了特異性CTL的增殖。 隨后采用T細(xì)胞增殖試驗及細(xì)胞毒性試驗鑒定異基因HLA-肽復(fù)合體誘導(dǎo)CTL的交叉識別能力。實(shí)驗數(shù)據(jù)顯示:HLA-B*4403誘導(dǎo)的CTL對B*1502、B*1518、B*3503誘導(dǎo)的CTL相互間交叉識別能力極弱,但B*1502、B*1518、B*3503誘導(dǎo)的CTL相互間卻具有明顯交叉識別現(xiàn)象,這說明HLA-B*4403相對于B*1502、B*1518及B*3503具有結(jié)構(gòu)與功能不相容性。 研究還分析了HLA-B*4403、B*1502、B*1518以及B*3503分子間結(jié)構(gòu)差異,HLA-B*4403與B*1502、B*1518、B*3503分子在F抗原結(jié)合槽處存在多個氨基酸殘基差異,這一方面佐證了F抗原結(jié)合槽對抗原呈遞以及TCR識別有重要作用,另一方面也說明體外異基因誘導(dǎo)CTL的交叉識別格局可以用于HLA結(jié)構(gòu)與功能差異的評價。以修正均方根偏差(RMSD-revised)表示分子間整體結(jié)構(gòu)差異,結(jié)果表明,HLA-B*4403與B*1502、B*1518、B*3503的結(jié)構(gòu)差異值比B*1502、B*1518、B*3503相互間的結(jié)構(gòu)差異值大,表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)與功能上的獨(dú)特性,進(jìn)一步說明通過HLA三維結(jié)構(gòu)差異評價HLA分子相容性有科學(xué)的實(shí)驗基礎(chǔ)支持。 綜上所述,本研究在國際上原創(chuàng)性地提出并完善了基于HLA空間結(jié)構(gòu)差異評價HLA相容性,以優(yōu)化選擇最佳HSCT移植供者的新理論,并在臨床HSCT患者中得到了初步證實(shí);建立并完善了一種以CTL對異基因HLA交叉識別格局來分析HLA功能相似性的體外評價模式,該評價模式對研究HLA相容性提供了有效手段,為HLA相容性的理論研究與應(yīng)用研究搭建一個科學(xué)、可行的體外技術(shù)平臺,為今后HLA相容性研究提供可靠的量化數(shù)據(jù)。相信通過實(shí)驗數(shù)據(jù)與臨床移植病例資料的不斷累積,定能繪制出完整的HLA分子相容性圖譜,為異基因造血干細(xì)胞移植以及器官移植篩選最佳供者提供新思路和技術(shù)支撐。
【圖文】：

)區(qū)域圖2-6. HLA-II分子RMSD計算(左)及RMSD-Revised計算(右)區(qū)域2.4 HLA三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫的采集整理及分析運(yùn)算結(jié)果包括整體RMSD值及Revised值，后臺數(shù)據(jù)用Microsoft OfficeAccess數(shù)據(jù)庫軟件管理，目前有160余萬條記錄。同時，我們用VC語言編制了數(shù)據(jù)庫管理工具——HLAStrucMark系統(tǒng)，能夠快捷簡便的進(jìn)行HLA-A、B、C、DRB1、DQB1、DPB1位點(diǎn)之間任意兩個分子的整體均方差距離的查詢。還能夠展示HLA分子之間不匹配氨基酸殘基的詳細(xì)資料，如：在分子中所處的具體位置，在該位置的氨基酸的功能，是否處于錨定殘基結(jié)合袋內(nèi)，是否于呈遞肽段結(jié)合以及是否與TCR結(jié)合等具體資料。這些資料在評價分子間的功能差異時，可以用作很重要的參考

201044圖2-7A. HLAStrucMark系統(tǒng)及后臺數(shù)據(jù)圖2-7B. HLAStrucMark系統(tǒng)及后臺數(shù)據(jù)2.5 HLA分子間均方根偏差分布整理HLA-A、-B、Cw、-DRB1、-DPB1及-DQB1位點(diǎn)計算的RMSD及RMSD-Revised數(shù)據(jù)，不同位點(diǎn)的結(jié)果分布各有特征，詳見圖2-8、2-9、2-10、2-11、2-12及2-13。各個位點(diǎn)修正后的RMSD值普遍減小，尤其是HLA-Cw位點(diǎn)較突出，而HLA-DRB1的計算結(jié)果經(jīng)過修正后整體分布并沒有太多改變。15.6%20.0%6.5%27.6%24.6%5.7%0
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R392

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本文編號：2585255