【摘要】： 目的: 1、通過比較和優(yōu)化用于SDS-PAGE電泳分析的血清樣品制備方法,建立簡便、靈敏的適合血清的小分子蛋白差異比較的技術(shù)。 2、運用生物學(xué)定量軟件對SDS-PAGE膠圖進(jìn)行分析,將電泳條帶的分子量和灰度進(jìn)行量化處理,轉(zhuǎn)換為可用于統(tǒng)計分析的數(shù)字形數(shù)據(jù)。 3、用生物信息學(xué)分析方法對所建立的用串聯(lián)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換方法將一維凝膠電泳技術(shù)用于血清差異蛋白組學(xué)研究的可行性進(jìn)行驗證。 方法: 1、運用鹽析法、有機(jī)溶劑法和親和層析柱法去除血清中高豐度蛋白,經(jīng)蛋白濃度測定和SDS-PAGE電泳分析,比較各方法對高豐度蛋白去除效果及小分子蛋白保留和分布情況。 2、分別使用二層Tris-SDS-PAGE法、三層Tris-SDS-PAGE法、Tricine-SDS-PAGE法、尿素-Tricine-SDS-PAGE法對樣品進(jìn)行分離,比較各方法對小分子蛋白分離的效果。 3、運用凝膠成像系統(tǒng)中的定量軟件Quantity One對各電泳圖上的各條帶進(jìn)行定量分析,將圖形結(jié)果轉(zhuǎn)換為數(shù)據(jù)結(jié)果。 4、將上述技術(shù)用于正常人和肝癌病人的血清的小分子蛋白差異分析,驗證該研究方法的可行性。 結(jié)果: 1、乙腈沉淀法能去除血清樣品中90%左右的高、中豐度蛋白,同時可殘留更多15kDa以下的小分子蛋白;鹽析沉淀法和親和層析柱法均能去除血清樣品中大部分高豐度蛋白,但這兩種方法去除高豐度蛋白后所得的15kDa以下的小分子蛋白較乙腈沉淀法所得到的相應(yīng)蛋白少,且親和層析柱法更能特異地只去除血清中的白蛋白和免疫球蛋白。 2、尿素-Tricine-SDS-PAGE能很好地分離血清中的小分子蛋白,比15%的二層Tris-SDS-PAGE、15%的三層Tris-SDS-PAGE、Tricine-SDS-PAGE分離效果更好,15kD以下的蛋白條帶清晰可見,更適合用軟件對各小分子量條帶進(jìn)行Quantity One軟件定量分析。 3、運用同前所述凝膠定量軟件Quantity One對膠圖中的泳道/條帶進(jìn)行定量法、等高線定量法分析并將結(jié)果轉(zhuǎn)換為數(shù)據(jù)后用SPSS13.0生物統(tǒng)計學(xué)方法對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗統(tǒng)計分析,結(jié)果表明,在ρ0.05,有10個條帶具有顯著差異。 結(jié)論: 1、用1.2倍體積乙腈沉淀法處理血清樣品可在去除絕大部分高、中豐度蛋白的同時收獲更多的15kDa以下的小分子量蛋白,適合用SDS-PAGE法對血清中15kDa以下的蛋白進(jìn)行差異研究。 2、尿素-Tricine-SDS-PAGE電泳在分離用乙腈沉淀法去除高豐度蛋白的血清樣品中具有明顯優(yōu)勢,15kDa以下的小分子條帶清晰。 3、使用凝膠定量軟件Quantity One對經(jīng)尿素-Tricine-SDS-PAGE分離的乙腈法去除高豐度蛋白的血清樣品進(jìn)行分析,具有可行性。 4、用以上所確定的最適方法對正常人和肝癌患者血清進(jìn)行驗證分析,表明一維凝膠電泳技術(shù)在血清差異蛋白初期比較研究中具有一定的可行性。
【圖文】：

度5%）；電泳上樣量為18μl，恒壓80V電泳至溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后將電壓升至120V，恒壓電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部，該實驗重復(fù)3次，結(jié)果一致，僅出示一次電泳結(jié)果，電泳結(jié)果如圖1-1所示，在200kDa至25kDa之間存在大量高豐度蛋白，在15kDa至10kDa之間的小分子蛋白無法清晰顯示。圖1-1 未除高豐度蛋白前三個標(biāo)準(zhǔn)樣品池SDS-PAGE圖。1為Fermentas Page Ruler蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（分子量200，150，120，100，85，70

圖1-2 不同濃度硫酸銨沉淀標(biāo)準(zhǔn)樣品池SDS-PAGE圖。1為Fermentas Page Ruler蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（分子量200，150，，120，100，85，70，60，50
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R341

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2584481