發(fā)布時間：2020-02-28 21:58

【摘要】： MxA蛋白是I型干擾素(INF-α/β)所誘導(dǎo)的蛋白,具有廣泛的抗病毒活性(主要針對RNA病毒)。此蛋白產(chǎn)物的誘導(dǎo)動力學(xué)特征與細(xì)胞的抗病毒狀態(tài)呈完全的平行,病毒感染時內(nèi)源性干擾素明顯升高,MxA可反映內(nèi)源性干擾素的狀態(tài),從而間接反映病毒感染,因此MxA量的升降可作為病毒感染的一個特異的指標(biāo)。在國外,該蛋白已經(jīng)引起了廣大研究者的關(guān)注,并進(jìn)行了深入的探討;在國內(nèi),近年來也逐漸引起學(xué)者的興趣。隨著MxA蛋白的深入研究,迫切需要制備對應(yīng)抗體來開展該項(xiàng)研究工作,而且MxA作為病毒感染的特異性指標(biāo),抗MxA單克隆抗體制劑本身也具有開發(fā)利用的潛能,具有廣闊的應(yīng)用前景。盡管國外已有該蛋白的特異性多抗和單抗,但均未商品化,在國內(nèi)并未曾有有關(guān)報(bào)道,因此我們有必要在國內(nèi)制備對應(yīng)的高特異性的多抗和單抗供廣大研究工作者使用,并研制MxA快速檢測試劑盒搶占中國市場,為廣大醫(yī)患服務(wù)。 本研究在已獲得該基因并重組入克隆載體的基礎(chǔ)上,通過基因工程方法構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-32a(+)-MxA,并在工程菌BL21中獲得高效表達(dá),蛋白含量可達(dá)菌體總蛋白量的25%,以割膠純化的純度達(dá)90%以上的目的蛋白進(jìn)行腹腔注射免疫小鼠并利用不同形式的MxA蛋白作為抗原對抗血清進(jìn)行特異性分析,結(jié)果表明獲得了特異性較高的抗血清;繼而使用PEG4000利用細(xì)胞融合技術(shù)將該蛋白免疫的Balb/c小鼠的脾臟細(xì)胞與鼠骨髓瘤細(xì)胞系Sp2/0細(xì)胞融合,經(jīng)三輪單克隆后成功地獲得了分泌該蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞,命名為雜交瘤細(xì)胞3C2,利用Western-blot、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫細(xì)胞熒光和免疫沉淀試驗(yàn)等各種免疫學(xué)方法檢測其抗體的特異性和效價,并通過抗體純化技術(shù)對大量制備的腹水進(jìn)行濃縮和純化,利用間接ELISA法對純化蛋白進(jìn)行效價評定,實(shí)驗(yàn)最終得到了高效而特異性強(qiáng)的抗MxA蛋白的單克隆抗體。所得結(jié)果不僅為MxA基因和MxA蛋白的理論研究提供免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)材料,也為研制MxA快速檢測試劑盒奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【圖文】：

片段(0.96kb，1.05kb)，，與預(yù)期的分子量一致（如圖 1-1）；（2）對該質(zhì)粒的雙酶切，切出分子量分別為 2kb、5.9kb 的二條 DNA 帶，而對照 pET-32a(+)質(zhì)粒僅切出一條分子量為5.9kb的DNA帶（如圖1-2）。說明MxA基因已經(jīng)正確的連接在pET-32a(+)載體上，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒 pET-32a(+)-MxA。2.2 pET-32a(+)-MxA 轉(zhuǎn)化菌的誘導(dǎo)表達(dá)將 pET-32a(+)-MxA 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原核表達(dá)系統(tǒng)菌株 BL21(DE3)，抽提質(zhì)粒并電泳鑒定，篩選出成功轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化菌 pET-32a(+)-MxA/BL21，并將該新鮮過夜培養(yǎng)菌按 1：100 接種于含 75μg/ml AMP 的 2YT 培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至 OD600為 0.5，補(bǔ)加 IPTG 至終濃度為 0.2mmol/L，28℃繼續(xù)培養(yǎng) 4h。收集菌體

導(dǎo)表達(dá)量最少（如圖 1-6）。通過上述結(jié)果，優(yōu)化出最佳誘導(dǎo)條件即 0.2mmol/l IPTG于 28℃ 誘導(dǎo) 4h。圖1-4 不同的IPTG誘導(dǎo)濃度對MxA基因表達(dá)影響a-g：0.2、0.6、1.0、1.4、1.6、1.8 和 2.0 mmol/L終濃度 IPTG 誘導(dǎo) 5h 的表達(dá)產(chǎn)物圖 1-3 pET-32a(+)-MxA/BL21 轉(zhuǎn)化菌的誘導(dǎo)表達(dá)a：預(yù)染蛋白分子量 Markeb：pET-32a(+)-MxA / BL21 誘導(dǎo)菌體蛋白c：pET-32a(+)-MxA /BL21 未誘導(dǎo)菌體蛋白d：pET-32a(+)/BL21 誘導(dǎo)前菌體蛋白e：pET-32a(+)/BL21 誘導(dǎo)菌體蛋白Trx-MxAa b c d e fa b c d e f g9766482619kD12
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392

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