【摘要】： MxA蛋白是I型干擾素(INF-α/β)所誘導的蛋白,具有廣泛的抗病毒活性(主要針對RNA病毒)。此蛋白產(chǎn)物的誘導動力學特征與細胞的抗病毒狀態(tài)呈完全的平行,病毒感染時內源性干擾素明顯升高,MxA可反映內源性干擾素的狀態(tài),從而間接反映病毒感染,因此MxA量的升降可作為病毒感染的一個特異的指標。在國外,該蛋白已經(jīng)引起了廣大研究者的關注,并進行了深入的探討;在國內,近年來也逐漸引起學者的興趣。隨著MxA蛋白的深入研究,迫切需要制備對應抗體來開展該項研究工作,而且MxA作為病毒感染的特異性指標,抗MxA單克隆抗體制劑本身也具有開發(fā)利用的潛能,具有廣闊的應用前景。盡管國外已有該蛋白的特異性多抗和單抗,但均未商品化,在國內并未曾有有關報道,因此我們有必要在國內制備對應的高特異性的多抗和單抗供廣大研究工作者使用,并研制MxA快速檢測試劑盒搶占中國市場,為廣大醫(yī)患服務。 本研究在已獲得該基因并重組入克隆載體的基礎上,通過基因工程方法構建原核表達載體pET-32a(+)-MxA,并在工程菌BL21中獲得高效表達,蛋白含量可達菌體總蛋白量的25%,以割膠純化的純度達90%以上的目的蛋白進行腹腔注射免疫小鼠并利用不同形式的MxA蛋白作為抗原對抗血清進行特異性分析,結果表明獲得了特異性較高的抗血清;繼而使用PEG4000利用細胞融合技術將該蛋白免疫的Balb/c小鼠的脾臟細胞與鼠骨髓瘤細胞系Sp2/0細胞融合,經(jīng)三輪單克隆后成功地獲得了分泌該蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞,命名為雜交瘤細胞3C2,利用Western-blot、免疫細胞化學、免疫細胞熒光和免疫沉淀試驗等各種免疫學方法檢測其抗體的特異性和效價,并通過抗體純化技術對大量制備的腹水進行濃縮和純化,利用間接ELISA法對純化蛋白進行效價評定,實驗最終得到了高效而特異性強的抗MxA蛋白的單克隆抗體。所得結果不僅為MxA基因和MxA蛋白的理論研究提供免疫學實驗材料,也為研制MxA快速檢測試劑盒奠定了堅實的基礎。
【圖文】：

片段(0.96kb，1.05kb)，，與預期的分子量一致（如圖 1-1）；（2）對該質粒的雙酶切，切出分子量分別為 2kb、5.9kb 的二條 DNA 帶，而對照 pET-32a(+)質粒僅切出一條分子量為5.9kb的DNA帶（如圖1-2）。說明MxA基因已經(jīng)正確的連接在pET-32a(+)載體上，成功構建了重組質粒 pET-32a(+)-MxA。2.2 pET-32a(+)-MxA 轉化菌的誘導表達將 pET-32a(+)-MxA 重組質粒轉化原核表達系統(tǒng)菌株 BL21(DE3)，抽提質粒并電泳鑒定，篩選出成功轉化的轉化菌 pET-32a(+)-MxA/BL21，并將該新鮮過夜培養(yǎng)菌按 1：100 接種于含 75μg/ml AMP 的 2YT 培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至 OD600為 0.5，補加 IPTG 至終濃度為 0.2mmol/L，28℃繼續(xù)培養(yǎng) 4h。收集菌體

導表達量最少（如圖 1-6）。通過上述結果，優(yōu)化出最佳誘導條件即 0.2mmol/l IPTG于 28℃ 誘導 4h。圖1-4 不同的IPTG誘導濃度對MxA基因表達影響a-g：0.2、0.6、1.0、1.4、1.6、1.8 和 2.0 mmol/L終濃度 IPTG 誘導 5h 的表達產(chǎn)物圖 1-3 pET-32a(+)-MxA/BL21 轉化菌的誘導表達a：預染蛋白分子量 Markeb：pET-32a(+)-MxA / BL21 誘導菌體蛋白c：pET-32a(+)-MxA /BL21 未誘導菌體蛋白d：pET-32a(+)/BL21 誘導前菌體蛋白e：pET-32a(+)/BL21 誘導菌體蛋白Trx-MxAa b c d e fa b c d e f g9766482619kD12
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R392

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 佘茜;徐蕾;何永林;靳志棟;張丹;楊春;;結核分枝桿菌PPE68蛋白的表達、鑒定及抗血清的制備[J];免疫學雜志;2011年09期

2 閻卉芳;沈宏偉;王向平;施小六;;兔抗人LOH12CR1抗血清的制備方法[J];腫瘤藥學;2011年04期

3 劉兵;曾華金;楊冉;雷利芳;屈凌波;;抗恩諾沙星抗血清的制備及其ELISA檢測[J];藥物分析雜志;2011年07期

4 王乃東;袁安文;鄧治邦;屠迪;許道軍;夏南松;楊大為;薛立群;;血清學檢測的雄性特異性抗原Fab抗體的特異性鑒定[J];畜牧獸醫(yī)學報;2011年08期

5 施海晶;王麗春;王晶晶;廖蕓;劉龍丁;;HSV-工誘導的細胞蛋白H347的初步分析[J];云南大學學報(自然科學版);2007年S3期

6 王健理;姚曉英;李大金;;重組乳酸桿菌Lb.hCGβ-C3d3經(jīng)鼻腔免疫BALB/c小鼠的抗生育潛能[J];中國免疫學雜志;2011年07期

7 劉沙洲;桑小雪;歐陽華學;雷紹榮;白林含;;新霉素ELISA檢測方法的建立[J];食品科學;2011年14期

8 葉維建;鄭玉濤;葉玲玲;蔡兆明;;胎兒供體胰腺胰島移植的解剖學觀察[J];遼寧醫(yī)學院學報;2011年04期

9 黎英榮;肖常青;戎健;潘海林;蘇宏業(yè);鄧宏明;;糖尿病大鼠陰莖組織糖基化終產(chǎn)物含量的變化和糖基化終產(chǎn)物受體的表達情況[J];中國糖尿病雜志;2007年09期

10 范泉水;鄭穎;王雙印;邱薇;張連江;尹惠瓊;李麗紅;;中國常見毒蛇抗蛇毒F(ab′)_2抗體制備[J];云南大學學報(自然科學版);2007年S3期

相關會議論文 前10條

1 馬春全;黃興國;鄧小雄;顧萬軍;;鴨卵黃IgG的純化及兔抗鴨IgG血清的制備[A];中國畜牧獸醫(yī)學會獸醫(yī)病理學分第12次暨中國動物病理生理學專業(yè)委員會第11次學術討論會論文集[C];2003年

2 魏群;賈振宇;陳萍;王林波;曹江;;eIF3g GST融合蛋白的表達與兔抗血清的制備[A];浙江省免疫學會第六次學術研討會論文匯編[C];2007年

3 徐國良;張卓輝;張增珠;張啟云;;雙黃連注射劑過敏癥動物模型的實驗研究[A];第九屆全國中藥和天然藥物學術研討會大會報告及論文集[C];2007年

4 范泉水;余方芳;鄭穎;;用生物信息學方法和多抗原表位DNA免疫方法設計制造生物毒素抗血清[A];第八屆中國生物毒素學術研討會論文摘要[C];2007年

5 趙丹慧;張艷;李成文;;人甲狀旁腺激素基因表達產(chǎn)物及合成肽抗體的制備[A];中國免疫學會第四屆學術大會會議議程及論文摘要集[C];2002年

6 雷紅濤;方堅生;孫遠明;王弘;沈玉棟;黃曉鈺;馮偉雯;;丁草胺人工抗原及抗體制備研究[A];提高全民科學素質、建設創(chuàng)新型國家——2006中國科協(xié)年會論文集[C];2006年

7 王朝輝;李大偉;韓成貴;于嘉林;;RBSDV P10蛋白原核表達及其抗血清的制備與應用[A];中國植物病理學會2004年學術年會論文集[C];2004年

8 王永久;由振東;崔瑞耀;路長林;何成;;大鼠腦中催產(chǎn)素受體cDNA的克隆和在大腸桿菌與CHO細胞內的表達[A];全面建設小康社會：中國科技工作者的歷史責任——中國科協(xié)2003年學術年會論文集（下）[C];2003年

9 嚴家彬;李新輝;吳淑勤;杜合軍;;鱖魚病毒核酸特異片段表達及高效價抗體制備[A];可持續(xù)水產(chǎn)養(yǎng)殖——資源、環(huán)境、質量——2003水產(chǎn)科技論壇論文集[C];2003年

10 周常文;馬紀萱;高遠;邁迪娜;呂兆啟;;抗雄烯二酮獨特型抗體的制備及其性質[A];中國細胞生物學學會第五次會議論文摘要匯編[C];1992年

相關重要報紙文章 前10條

1 管維邋石先來;中山局研制出植物病毒抗血清[N];中國國門時報;2008年

2 海波邋通訊員 石先來;中山研制出三種病毒抗血清[N];廣東科技報;2008年

3 記者 黃啟艷邋通訊員 管維 石先來;其潛在價值超過億元[N];中山日報;2008年

4 王永坤 錢鐘 秦淑美 王暉;防治小鵝瘟的有效措施[N];中國畜牧報;2005年

5 張永振;被動物咬傷后怎么辦[N];健康報;2006年

6 方成;植物病毒檢疫技術獲得突破[N];中國知識產(chǎn)權報;2008年

7 本報記者 王均珠;狂犬病防治還有待加強[N];貴陽日報;2008年

8 徐述湘;規(guī)范預防措施以減少狂犬病[N];中國醫(yī)藥報;2004年

9 胡德斌;應用滅活疫苗防鵝疫[N];農(nóng)民日報;2006年

10 東平縣畜牧局 董澤秋 張燦東 劉琰冰 提供;蛋鴨的疾病與防治[N];山東科技報;2006年

相關博士學位論文 前10條

1 李永芹;養(yǎng)殖魚類病原菌檢測芯片技術的建立[D];中國海洋大學;2010年

2 陳婷梅;人胱抑素C抗體制備和檢測方法建立及其方法學評價[D];重慶醫(yī)科大學;2007年

3 王瑞琳;SARS冠狀病毒分離鑒定、疫苗構建及免疫血清制備研究[D];吉林大學;2006年

4 王潔;沙眼衣原體感染體液免疫應答譜的建立及Tarp蛋白生物學特性的研究[D];中南大學;2011年

5 吳潤;偶蹄動物朊蛋白基因結構特征及其重組蛋白抗原性的研究[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學;2004年

6 侯秋蓮;應用SSH技術研究氧化脅迫下細粒棘球蚴基因的表達[D];新疆大學;2008年

7 李萌;CD20分子模擬表位肽的篩選及其疫苗構建[D];第四軍醫(yī)大學;2006年

8 呂俊;LINGO-1多克隆抗體的制備及其被動免疫治療大鼠急性脊髓損傷的實驗研究[D];南方醫(yī)科大學;2010年

9 陳益國;金葡菌肽聚糖模擬肽疫苗候選保護性作用的初步研究[D];南方醫(yī)科大學;2011年

10 江紅;幽門螺桿菌空泡毒素基因分段克隆、表達和活性研究[D];第四軍醫(yī)大學;2001年

相關碩士學位論文 前10條

1 劉鵬;MxA蛋白的抗體制備及其特異性分析[D];蘇州大學;2008年

2 李緒友;昆蟲圍食膜蛋白抗體對桿狀病毒感染性的影響[D];華中師范大學;2006年

3 姜艷華;豬鏈球菌不同血清型抗血清的制備及在病原流行病學調查中的應用[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2008年

4 曾華金;CMV-CP基因高效表達與抗血清的制備[D];華南熱帶農(nóng)業(yè)大學;2003年

5 陸健康;抗玉米赤霉烯酮和抗脫氧雪腐鐮刀菌烯醇抗體的制備及性質分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2010年

6 李德昆;河豚毒素的快速檢測方法研究[D];中國海洋大學;2004年

7 李袁飛;凋亡相關新基因apr-2的克隆、表達及多克隆抗血清的制備[D];第四軍醫(yī)大學;2004年

8 呼都特;蒙古馬不同類群MxA基因的部分外顯子多態(tài)性分析及MxA基因真核載體的構建[D];內蒙古農(nóng)業(yè)大學;2010年

9 趙海林;人Tenascin-R蛋白EGFL片段抗血清治療中樞神經(jīng)損傷的體外研究[D];南方醫(yī)科大學;2012年

10 胡春超;兔抗ES細胞免疫血清對附植前小鼠胚胎的作用[D];河北農(nóng)業(yè)大學;2012年

本文編號：2583571