【摘要】： 結(jié)核病(Tuberculosis,TB)是由結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)所致以呼吸系統(tǒng)感染為主的慢性傳染病。唯一的預(yù)防疫苗卡介苗(bacille calmetteguerin, BCG)保護(hù)性不完善,需有效的疫苗來控制TB的傳播與蔓延。結(jié)核分枝桿菌亞單位疫苗的研究有望解決卡介苗預(yù)防結(jié)核效果不穩(wěn)定的問題。研究發(fā)現(xiàn)MTB培養(yǎng)上清濾液蛋白(culture filtrate protein, CFP)中Ag85B和ESAT6均能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng),是機(jī)體抗結(jié)核感染的有效靶抗原。因此,本試驗(yàn)通過構(gòu)建融合表達(dá)Ag85B-ESAT6的原核表達(dá)載體,獲得Ag85B-ESAT6融合蛋白,測定分析該蛋白在小鼠體內(nèi)的免疫學(xué)特性和抵抗MTB感染的保護(hù)力。 1.采用PCR方法分別從MTB H37Rv株DNA基因組中擴(kuò)增Ag85B和ESAT6基因,在ESAT6基因上游引入48bp的柔性linker結(jié)構(gòu),確保兩蛋白的正確折疊。將各目的片段克隆至pMD18-T載體中進(jìn)行測序。鑒定陽性重組質(zhì)粒pMD18-T-Ag85B和pMD18-T-ESAT6,經(jīng)測序證實(shí)與Genebank公布的基因序列完全一致。將Ag85B和ESAT6基因亞克隆入pPROEXHTa原核表達(dá)載體,酶切鑒定陽性重組質(zhì)粒pPROEXHTa-Ag85B-ESAT6,并用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE檢測和Western-blot鑒定表明,在相對(duì)分子量為45 kD的位置有特異性目的蛋白表達(dá)。采用Ni-NTA親和色譜柱在變性條件下純化得到了Ag85B-ESAT6融合蛋白。 2.用Ag85B-ESAT6原核表達(dá)融合蛋白免疫BALB/c小鼠,用ELISA檢測證明,免疫小鼠血清中的特異性抗體滴度達(dá)到1∶12 800。將BALB/c小鼠用MTB毒株H37Rv經(jīng)尾靜脈注射感染。4周后,脫頸處死小鼠,無菌條件下進(jìn)行脾臟和肺臟勻漿,倍比稀釋后接種于7H10平板,37℃培養(yǎng)3～4周,計(jì)數(shù)細(xì)菌菌落形成單位(cloning forming units,CFU),以觀察免疫小鼠對(duì)MTB毒株攻擊的抵抗作用。結(jié)果表明,與生理鹽水組相比,試驗(yàn)組和BCG組對(duì)MTB在脾臟和肺臟中的增殖均有抵抗作用(P 0.05);但與BCG組相比,試驗(yàn)組對(duì)MTB在脾臟和肺臟中增殖的抵抗作用不如BCG組(P 0.05)。 在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)并純化出Ag85B-ESAT6融合蛋白,該蛋白能夠分別與Ag85B和ESAT6的mAb發(fā)生特異性反應(yīng),表明具有一定的生物活性。小鼠免疫結(jié)果顯示:Ag85B-ESAT6能誘發(fā)一定水平的細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答,并產(chǎn)生一定的免疫保護(hù)力,可以抵御MTB的感染。為進(jìn)一步研究Ag85B-ESAT6疫苗的免疫學(xué)特性及與其他疫苗的優(yōu)勢(shì)組合,用于TB新型疫苗的開發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和物質(zhì)基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 2-1Ag85B 和 ESAT6 基因的 PCR 產(chǎn)物酸 marker DL2000；2.ESAT6 基因的 PCR 產(chǎn)物；3.Ag85B 基因的 PCFig 2-1 PCR amplification products of Ag85B and ESAT6 genearker DL2000；2. PCR products of ESAT6 gene；3. PCR products of A和 ESAT6 基因表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 EcoRI 和 HindIII ， EcoRI 和 ClaI ， ClaI 和 HindIII 雙 酶 切-Ag85B-ESAT6，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測到大小約為1 191 bp，85 pPROEXHTa-Ag85B-ESAT6 構(gòu)建成功（圖2-2）。測序結(jié)果的 Ag85B和ESAT6 基因一致。

分 別 用 EcoRI 和 HindIII ， EcoRI 和 ClaI ， ClaI 和 HindIII 雙 酶 切 重 組 質(zhì) 粒pPROEXHTa-Ag85B-ESAT6，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測到大小約為1 191 bp，855 bp，，328 bp的片斷，證明 pPROEXHTa-Ag85B-ESAT6 構(gòu)建成功（圖2-2）。測序結(jié)果與 GenBank數(shù)據(jù)庫所收錄的 Ag85B和ESAT6 基因一致。圖 2-2 重組質(zhì)粒 pPROEXHTa-Ag85B-ESAT6 的酶切鑒定1.核酸 marker DL2000；2. 重組質(zhì)粒pPROEXHTa-Ag85B-ESAT6被EcoRI和HindIII雙酶切；3. 重組質(zhì)粒pPROEXHTa-Ag85B-ESAT6被ClaI和HindIII雙酶切；4. 重組質(zhì)粒pPROEXHTa-Ag85B-ESAT6被EcoRI和ClaI雙酶切Fig 2-2 Recombinant plasmid pPROEXHTa-Ag85B-ESAT6 by digestion1.DNA marker DL2000; 2. Recombinant plasmid pPROEXHTa-Ag85B-ESAT6 by EcoR I and Hind IIIdigestion; 3. Recombinant plasmid pPROEXHTa-Ag85B-ESAT6 by Cla I and Hind III digestion;4. Recombinant plasmid pPROEXHTa-Ag85B-ESAT6 by EcoR I and Cla I digestion24
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2583556