【摘要】： 結(jié)核病(Tuberculosis,TB)是由結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)所致以呼吸系統(tǒng)感染為主的慢性傳染病。唯一的預(yù)防疫苗卡介苗(bacille calmetteguerin, BCG)保護(hù)性不完善,需有效的疫苗來控制TB的傳播與蔓延。結(jié)核分枝桿菌亞單位疫苗的研究有望解決卡介苗預(yù)防結(jié)核效果不穩(wěn)定的問題。研究發(fā)現(xiàn)MTB培養(yǎng)上清濾液蛋白(culture filtrate protein, CFP)中Ag85B和ESAT6均能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng),是機(jī)體抗結(jié)核感染的有效靶抗原。因此,本試驗通過構(gòu)建融合表達(dá)Ag85B-ESAT6的原核表達(dá)載體,獲得Ag85B-ESAT6融合蛋白,測定分析該蛋白在小鼠體內(nèi)的免疫學(xué)特性和抵抗MTB感染的保護(hù)力。 1.采用PCR方法分別從MTB H37Rv株DNA基因組中擴(kuò)增Ag85B和ESAT6基因,在ESAT6基因上游引入48bp的柔性linker結(jié)構(gòu),確保兩蛋白的正確折疊。將各目的片段克隆至pMD18-T載體中進(jìn)行測序。鑒定陽性重組質(zhì)粒pMD18-T-Ag85B和pMD18-T-ESAT6,經(jīng)測序證實與Genebank公布的基因序列完全一致。將Ag85B和ESAT6基因亞克隆入pPROEXHTa原核表達(dá)載體,酶切鑒定陽性重組質(zhì)粒pPROEXHTa-Ag85B-ESAT6,并用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE檢測和Western-blot鑒定表明,在相對分子量為45 kD的位置有特異性目的蛋白表達(dá)。采用Ni-NTA親和色譜柱在變性條件下純化得到了Ag85B-ESAT6融合蛋白。 2.用Ag85B-ESAT6原核表達(dá)融合蛋白免疫BALB/c小鼠,用ELISA檢測證明,免疫小鼠血清中的特異性抗體滴度達(dá)到1∶12 800。將BALB/c小鼠用MTB毒株H37Rv經(jīng)尾靜脈注射感染。4周后,脫頸處死小鼠,無菌條件下進(jìn)行脾臟和肺臟勻漿,倍比稀釋后接種于7H10平板,37℃培養(yǎng)3～4周,計數(shù)細(xì)菌菌落形成單位(cloning forming units,CFU),以觀察免疫小鼠對MTB毒株攻擊的抵抗作用。結(jié)果表明,與生理鹽水組相比,試驗組和BCG組對MTB在脾臟和肺臟中的增殖均有抵抗作用(P 0.05);但與BCG組相比,試驗組對MTB在脾臟和肺臟中增殖的抵抗作用不如BCG組(P 0.05)。 在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)并純化出Ag85B-ESAT6融合蛋白,該蛋白能夠分別與Ag85B和ESAT6的mAb發(fā)生特異性反應(yīng),表明具有一定的生物活性。小鼠免疫結(jié)果顯示:Ag85B-ESAT6能誘發(fā)一定水平的細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答,并產(chǎn)生一定的免疫保護(hù)力,可以抵御MTB的感染。為進(jìn)一步研究Ag85B-ESAT6疫苗的免疫學(xué)特性及與其他疫苗的優(yōu)勢組合,用于TB新型疫苗的開發(fā)提供了實驗數(shù)據(jù)和物質(zhì)基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 2-1Ag85B 和 ESAT6 基因的 PCR 產(chǎn)物酸 marker DL2000；2.ESAT6 基因的 PCR 產(chǎn)物；3.Ag85B 基因的 PCFig 2-1 PCR amplification products of Ag85B and ESAT6 genearker DL2000；2. PCR products of ESAT6 gene；3. PCR products of A和 ESAT6 基因表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 EcoRI 和 HindIII ， EcoRI 和 ClaI ， ClaI 和 HindIII 雙 酶 切-Ag85B-ESAT6，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測到大小約為1 191 bp，85 pPROEXHTa-Ag85B-ESAT6 構(gòu)建成功（圖2-2）。測序結(jié)果的 Ag85B和ESAT6 基因一致。

分 別 用 EcoRI 和 HindIII ， EcoRI 和 ClaI ， ClaI 和 HindIII 雙 酶 切 重 組 質(zhì) 粒pPROEXHTa-Ag85B-ESAT6，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測到大小約為1 191 bp，855 bp，，328 bp的片斷，證明 pPROEXHTa-Ag85B-ESAT6 構(gòu)建成功（圖2-2）。測序結(jié)果與 GenBank數(shù)據(jù)庫所收錄的 Ag85B和ESAT6 基因一致。圖 2-2 重組質(zhì)粒 pPROEXHTa-Ag85B-ESAT6 的酶切鑒定1.核酸 marker DL2000；2. 重組質(zhì)粒pPROEXHTa-Ag85B-ESAT6被EcoRI和HindIII雙酶切；3. 重組質(zhì)粒pPROEXHTa-Ag85B-ESAT6被ClaI和HindIII雙酶切；4. 重組質(zhì)粒pPROEXHTa-Ag85B-ESAT6被EcoRI和ClaI雙酶切Fig 2-2 Recombinant plasmid pPROEXHTa-Ag85B-ESAT6 by digestion1.DNA marker DL2000; 2. Recombinant plasmid pPROEXHTa-Ag85B-ESAT6 by EcoR I and Hind IIIdigestion; 3. Recombinant plasmid pPROEXHTa-Ag85B-ESAT6 by Cla I and Hind III digestion;4. Recombinant plasmid pPROEXHTa-Ag85B-ESAT6 by EcoR I and Cla I digestion24
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 張翠英;董恩軍;朱琳;張靈霞;;esat6-重組卡介苗對結(jié)核病預(yù)防作用的研究[J];傳染病信息;2006年04期

2 師長宏,范雄林,徐志凱,李元,柏銀蘭,薛瑩;融合表達(dá)Ag85B-ESAT6的結(jié)核分枝桿菌真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其免疫原性[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2004年02期

3 師長宏;安家澤;唐小鳳;王曉武;張海;柏銀蘭;徐志凱;;結(jié)核分枝桿菌MPT64-ESAT6融合蛋白在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答及其保護(hù)力[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2006年09期

4 胡佳杰,文學(xué)明,肖愛清,黃海浪;重組BCG-HSP70疫苗有關(guān)毒性實驗研究[J];廣西預(yù)防醫(yī)學(xué);2002年04期

5 趙寶華,張莉,石振華;基因重組卡介苗的優(yōu)點及應(yīng)用[J];生物學(xué)通報;2002年01期

6 范雄林,徐志凱,李元,李別虎,薛瑩,柏銀蘭,白光春,賈向志;結(jié)核分枝桿菌Ag85B基因疫苗免疫保護(hù)作用的初步研究[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2003年01期

7 龔真莉;陳國棟;劉光遠(yuǎn);;結(jié)核分枝桿菌的分子生物學(xué)特點[J];畜牧獸醫(yī)雜志;2007年03期

8 劉劍君;幺鴻雁;;我國結(jié)核病的流行現(xiàn)狀和防治對策[J];預(yù)防醫(yī)學(xué)論壇;2006年05期

9 師長宏,范雄林,徐志凱,李元,柏銀蘭,薛瑩;結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白Ag85B-ESAT6的融合表達(dá)及純化[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2004年02期

10 師長宏,徐志凱,朱德生,李元,柏銀蘭,薛瑩;分泌表達(dá)Ag85B與ESAT6融合蛋白的重組卡介苗菌株的篩選[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2005年04期

本文編號：2583556