【摘要】： 研究目的： 隨著電力事業(yè)的飛速發(fā)展和各種電器設備的廣泛應用，人們生活空間中所接觸到的工頻磁場輻射日益增多。許多研究表明工頻磁場是危害性非常大的污染源，嚴重影響人體健康。因此，工頻磁場的生物效應便成為生物電磁學領域的一個重要課題。 在人體各系統(tǒng)中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)是對電磁輻射最敏感的系統(tǒng)，神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，要深入探討工頻磁場對神經(jīng)系統(tǒng)的生物學作用，，就必須開展工頻磁場對神經(jīng)元作用的研究。工頻磁場對神經(jīng)元的生物學效應是磁場和神經(jīng)元共同作用的結(jié)果，是與兩者的參數(shù)密切相連的。工頻磁場的強度、作用時間，接受磁場作用的神經(jīng)元的來源、部位、生長狀態(tài)等參數(shù)都是影響工頻磁場生物學效應的主要因素。 本課題對體外培養(yǎng)胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元施加工頻磁場輻射，旨在探討工頻磁場(50-60Hz)對胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的損傷效應，并綜合分析其可能機制。 研究方法： 以Wistar孕大鼠13．5～14d的胚胎原代培養(yǎng)的大腦皮質(zhì)神經(jīng)元為實驗材料。神經(jīng)元培養(yǎng)48h后，隨機分為對照組和實驗組，對實驗組神經(jīng)元施加工頻磁場輻射，主要參數(shù)選擇：重復頻率50Hz、平均場強0．3mT，30min／次，3次／d，共2d。輻射完畢12h后，分別對對照組和實驗組神經(jīng)元進行以下檢測： 1．細胞形態(tài)學觀察： (1)倒置顯微鏡觀察：在倒置顯微鏡下觀察神經(jīng)元的生長情況。 (2)透射電子顯微鏡觀察：輻射完畢12h后，3％戊二醛預固定10min，用細胞刮刮下細胞并轉(zhuǎn)移到離心管中，經(jīng)離心、固定、脫水、包埋、切片、染色等處理，JEM-1200EX型透射電子顯微鏡觀察記錄。 (3)掃描電子顯微鏡觀察：將細胞接種于預置蓋玻片的培養(yǎng)板中，輻射完畢12h后，2．5％戊二醛前固定，用0．1mol／L磷酸緩沖液沖洗數(shù)次，1％鋨酸后固定，再用乙醇梯度脫水，醋酸異戊酯置換，二氧化碳臨界干燥，高真空蒸發(fā)儀噴鍍，掃描電子顯微鏡觀察記錄。 2．相對存活率測定：四甲基偶氮噻唑藍比色法(MTT)測定實驗組神經(jīng)元的相對存活率。 3．細胞死亡的檢測：采用Ho33342、PI熒光雙染的方法觀察對照組和實驗組的細胞死亡情況。 4．流式細胞術(shù)測定神經(jīng)元胞漿內(nèi)游離Ca~(2+)濃度的變化：收集細胞，加Fluo3／AM至終濃度為10μmol／L，避光孵育1h。利用流式細胞儀檢測(激發(fā)波長為506nm，發(fā)射波長為526nm)，取10000個神經(jīng)元熒光強度值的平均值為各組測定值。 5．流式細胞術(shù)測定線粒體膜電位：收集細胞，加羅丹明123至終濃度為10μg／ml，孵育30min。利用流式細胞儀檢測(激發(fā)波長為488nm，發(fā)射波長為530nm)，取10000個神經(jīng)元熒光強度值的平均值為各組測定值。 6．脂質(zhì)過氧化測定：輻射完畢12小時后收集細胞(10~6個)；超聲波破碎細胞；4℃超速離心機12000rpm／m離心15分鐘后取上清；依試劑盒說明書進行各步驟反應；721分光光度儀分別測定各組細胞內(nèi)MDA含量和SOD活性。 結(jié)果： 1．細胞形態(tài)學觀察： (1)倒置顯微鏡觀察：對照組神經(jīng)元24h后絕大多數(shù)已貼壁，分散均勻；有的神經(jīng)元伸出長短不等的突起，少數(shù)神經(jīng)元之間已建立突起聯(lián)系。培養(yǎng)48h后，神經(jīng)元之間已建立廣泛的突起聯(lián)系。96h后神經(jīng)元胞體飽滿，立體感強，神經(jīng)元的突起表面平滑。實驗組神經(jīng)元生長狀態(tài)欠佳，胞體欠飽滿，神經(jīng)元之間也有突起聯(lián)系，但是突起表面粗糙，與對照組神經(jīng)元的形態(tài)有明顯差異。 (2)透射電子顯微鏡觀察：對照組神經(jīng)元常染色質(zhì)豐富；胞漿中線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復合體豐富，胞漿及突起內(nèi)富含微管、微絲。實驗組神經(jīng)元胞漿內(nèi)部分線粒體嵴排列紊亂，偶見巨大線粒體；大量神經(jīng)元胞漿中自噬體和殘余溶酶體明顯增多，有的甚至充滿細胞漿，高倍下可見這些小體由單層膜或雙層膜包繞，呈高電子密度；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，腔內(nèi)潴留物增多，高爾基復合體欠發(fā)達。 (3)掃描電子顯微鏡觀察：對照組神經(jīng)元有大量的長短不一的突起，伸出的突起與臨近細胞的突起相連，胞體及突起表面光滑。實驗組與對照組相比細胞形態(tài)發(fā)生明顯的變化，細胞突起收縮、斷裂，胞間連接斷裂，胞體及突起欠光滑，其表面有較多毛刺狀突起，胞質(zhì)中可見較多顆粒。 2．細胞死亡的檢測： Ho33342和PI雙標：對照組中的細胞核質(zhì)均勻，呈現(xiàn)藍色熒光；磁場照射組出現(xiàn)呈紅色熒光的壞死細胞，部分細胞出現(xiàn)染色質(zhì)凝集、邊緣化現(xiàn)象。 3．相對存活率測定：對照組和實驗組神經(jīng)元光密度(A_(570))值分別為0．515±0．029和0．398±0．016。 4．神經(jīng)元胞漿內(nèi)游離Ca~(2+)濃度的測定：對照組和實驗組神經(jīng)元胞漿內(nèi)游離Ca~(2+)平均熒光強度分別為91．23±1．16和88．42±2．08。 5．線粒體膜電位測定：對照組和實驗組神經(jīng)元線粒體膜電位平均熒光強度分別為63．34±1．55和44．36±1．73。 6．脂質(zhì)過氧化測定：對照組和實驗組神經(jīng)元MDA含量分別為13．24±0．36和18．67±0．45；對照組和實驗組神經(jīng)元SOD活性分別為32．98±1．35和17.74±0.96。 結(jié)論： 本實驗條件下，工頻磁場(重復頻率50Hz、平均場強0．3mT)可導致體外培養(yǎng)的胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的形態(tài)發(fā)生明顯變化，并可抑制其生長，造成其代謝異常、線粒體膜電位降低、MDA含量升高和SOD活性降低。胞漿內(nèi)游離Ca~(2+)濃度基本無變化，可能是與輻射時間的長短、輻射次數(shù)及輻射完畢與收集細胞之間的時間間隔有關。因此，探討工頻磁場的生物學效應需要綜合分析多項指標，并應深入考慮。 意義： 本課題選擇工頻磁場(50Hz)作用于體外培養(yǎng)的胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元，揭示了工頻磁場輻射對離體神經(jīng)元的損傷效應及其可能機制，為進一步探討工頻磁場對神經(jīng)系統(tǒng)的生物學效應及其機制提供了實驗資料。
【圖文】：

對照組和實驗組神經(jīng)元光密度(A57。)值分別為0.515士0.029和0.398士0.實驗組神經(jīng)元相對存活率為77.28%，兩組差異有統(tǒng)計學意義護<0.01)。兩組元的A57。值及相對存活率見表1及圖6。表1MTT法測定神經(jīng)元相對存活率(，士‘，n=8)琳le1Therelativevi汕ility。fneuronsoftwo腳ups(釜士‘，n=8)組別A57。值細胞相對存活率(%)對照組實驗組0.515士0.029100.000.398士0.016*77.28**尸<0.01VS對照組*P<0.01VSConlr01GrouP

對照組和實驗組神經(jīng)元胞漿內(nèi)游離c擴+平均熒光強度分別為91.23士1.16和88.4肚2.08，實驗組比對照組降低3.08%，兩組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。兩組神經(jīng)元線粒體膜電位平均熒光強度值見表2及圖7。表2神經(jīng)元胞漿內(nèi)游離鈣離子熒光強度(王士才，n=10000)琳 le2Fluoreseeneevalueorthe毗aeellular。 aleiumeoneentration(釜士，，n一10000)組別熒光強度對照組實驗組 91.23士1.1688.42士2.08**乃 0.05VS對照組*介 0.05VSControlGrouP CUnU0

本文編號：2583595