【摘要】： 目的細胞內(nèi)膽固醇主要來源于兩個方面,即外源性膽固醇攝入和內(nèi)源性膽固醇合成,它們均通過一個依賴于細胞內(nèi)膽固醇水平的反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)的嚴密控制來保證膽固醇的內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡,即主要通過SCAP-SREBP2-LDLr/HMGCoA reductase通路實現(xiàn)對細胞內(nèi)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)平衡的調(diào)節(jié)。過去的研究中,我們已經(jīng)證實炎癥可以通過干擾膽固醇介導(dǎo)的LDLr負反饋調(diào)節(jié)來促進外周細胞,如血管平滑肌細胞(VSMCs)及腎小球系膜細胞(HMCs)的膽固醇攝入,同時下調(diào)ABCA1基因表達來減少膽固醇外流,從而導(dǎo)致膽固醇在外周細胞異常堆積形成泡沫細胞。本研究在過去研究的基礎(chǔ)上,選用人THP-1巨噬細胞和VSMCs細胞,①探討炎癥是否干擾巨噬細胞內(nèi)LDLr負反饋調(diào)控,從而導(dǎo)致巨噬細胞大量攝入天然LDL形成泡沫細胞;②探討炎癥導(dǎo)致VSMCs細胞內(nèi)膽固醇敏感器SCAP從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)異常逃逸到高爾基體的分子機制;③比較生理條件及炎癥狀態(tài)下,巨噬細胞和VSMCs細胞LDLr負反饋調(diào)控的差異。 材料和方法用酶學(xué)法分別檢測THP-1巨噬細胞和VSMCs細胞內(nèi)總膽固醇(TC)、游離膽固醇(FC)和膽固醇酯(CE)的水平;油紅O染色觀察細胞內(nèi)脂質(zhì)積聚情況;提取細胞總RNA,應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)(real-time quantitative PCR)檢測LDLr、SREBP2、SCAP、α-mannosidaseⅡ、SR-A和CD36 mRNA水平;用Western blotting法檢測LDLr、SREBP2和SCAP蛋白表達水平;用免疫細胞化學(xué)法檢測α-mannosidaseⅡ蛋白表達水平;用抗人SCAP抗體和抗高爾基體抗體雙重染色后,激光共聚焦顯微鏡下觀察兩種細胞SCAP-SREBP2復(fù)合物在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的定位;用免疫熒光法檢測巨噬細胞SR-A的蛋白表達;應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測兩種細胞培養(yǎng)基中腫瘤壞死因子alpha(TNF-α)水平;應(yīng)用MTT法檢測兩種細胞在不同時間、不同濃度LPS刺激下的存活率。 結(jié)果1.我們證實LPS通過LDLr增加天然LDL在巨噬細胞內(nèi)積聚。進一步,我們研究了炎癥狀態(tài)下,調(diào)控LDLr表達的兩個重要分子SCAP和SREBP2的表達和細胞內(nèi)轉(zhuǎn)位。實驗證實LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)增加SCAP和SREBP2 mRNA和蛋白表達,進而增大SCAP/Insig1比率,導(dǎo)致Insig1數(shù)量不足,不足以鎖定SCAP-SREBP2復(fù)合物,造成SCAP-SREBP2復(fù)合物即使在胞內(nèi)高濃度膽固醇水平下,仍從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)逃逸到高爾基體。這種異常逃逸打破了LDLr的生理性負反饋調(diào)節(jié),進而將THP-1巨噬細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽毎?2.我們的實驗證實高爾基體α甘露糖苷酶Ⅱ(α-mannosidaseⅡ)特異性抑制劑苦馬豆堿(swainsonine)能顯著抑制VSMCs細胞SCAP的異常逃逸,減少SCAP-SREBP2復(fù)合物從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)位至高爾基體,同時抑制SCAP和SREBP2 mRNA和蛋白表達,最終減少LDLr表達和外源性膽固醇的攝入,逆轉(zhuǎn)炎癥誘導(dǎo)的泡沫細胞形成,提示SCAP異常糖基化修飾可能是炎癥導(dǎo)致其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體間異常循環(huán)的機制之一。同時,我們也觀察到苦馬豆堿的抑制效應(yīng)只在濃度為2.5和5μg/ml時出現(xiàn),7.5μg/ml的苦馬豆堿反而上調(diào)LDLr表達�？囫R豆堿對α-mannosidaseⅡ特異性抑制,反饋性增加α-mannosidaseⅡmRNA和蛋白表達。 3.生理情況下,巨噬細胞和VSMCs細胞負荷不同濃度LDL,兩種細胞LDLr表達都顯著減少,但VSMCs細胞LDLr的下調(diào)比巨噬細胞快,而且下調(diào)幅度更大,提示其“下調(diào)敏感”,可以迅速關(guān)閉LDLr,減少脂質(zhì)攝取;當(dāng)有LPS存在時,兩種細胞LDLr表達均上調(diào),但巨噬細胞LDLr被LPS上調(diào)的更快,幅度更大,提示其“上調(diào)易感”。同時,我們證實巨噬細胞SR-A水平表達遠遠高于單核細胞和VSMCs細胞。 結(jié)論我們證實:炎癥可以導(dǎo)致巨噬細胞通過LDLr途徑大量攝入天然LDL,從而導(dǎo)致泡沫細胞形成,氧化LDL不是巨噬細胞泡沫化的唯一膽固醇來源,天然LDL同樣可以致動脈粥樣硬化,這可能是巨噬細胞泡沫樣變的另一條通路;炎癥可以增加高爾基體α-mannosidaseⅡ的活性,加強對SCAP的糖基化修飾,同時增加SCAP和SREBP2 mRNA和蛋白表達,促進SCAP從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)異常逃逸到高爾基體,從而增加核轉(zhuǎn)錄因子SREBP2-N進入胞核,啟動LDLr表達,增加膽固醇攝入,導(dǎo)致泡沫細胞形成;在生理情況下,加載LDL時,VSMCs細胞LDLr下調(diào)比巨噬細胞明顯、下調(diào)幅度更大,在炎癥刺激物L(fēng)PS作用下,巨噬細胞LDLr上調(diào)迅速,而且上調(diào)幅度更大,提示炎癥狀態(tài)下巨噬細胞比VSMCs細胞更容易發(fā)生泡沫樣改變。
【圖文】：

圖2THP一l巨噬細胞誘導(dǎo)型sR一A表達ndueibleSR一AexPressioninTHP一1maeroPhages.THP一1macroPhageswfullybyPMA.IndueibleSR一AexPressionwasdeteetedbyimmunofluoreseeedinmethodseetion.ArePresentsnegativeeontrol.同濃度LPs及處理時間對巨噬細胞存活率的影響驗結(jié)果見表l。l一1000ng/mlLPs在各個時間點對巨噬細胞存活率，均可以用于細胞實驗。檢測時間l小時LPS濃度(ng/ml)0OD值存活1105010010001.728士0.2513461.753667士0.0522141.742士0.078102!.678667士0.1555551.623333土0.1442371.586333士0.176976111

exPeriments15shown. 3.7LPS對巨噬細胞SR-A和 CD36mRNA表達的影響實驗結(jié)果見圖4一4A、B。LPS在單獨處理或與LDL共負荷時都沒有增加SR一A和 CD36mRNA表達，，而且表達減少，提示清道夫受體途徑?jīng)]有參與LPS誘導(dǎo)的細胞內(nèi)膽固醇聚集。(工日luo。 JPlo召)之名閱丈日.州的LDL(25林g/ml)LPS(200ng/ml)+++一LDL(25pg/ml)LPS(200ng/Inl)SR一AmRNAlevel(mean士SD)0.5均.20.1士0.080.21士0.15
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R363

【引證文獻】

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1 朱婷婷;王雙;方嚴;練雪梅;;炎癥對高脂狀態(tài)下肺泡Ⅱ型上皮細胞脂質(zhì)蓄積的影響[J];中國生物制品學(xué)雜志;2012年11期

本文編號：2583405