【摘要】： 目的 人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)感染是引起宮頸癌的主要病因,高危型HPV16是主要的感染類型。而HPV并非宮頸癌發(fā)生發(fā)展的唯一因素,單純皰疹病毒(Herpes simplex virus,HSV)可能作為協(xié)同因子在宮頸癌變發(fā)生發(fā)展的過程中起重要作用。用PCR法從HPV中擴(kuò)增出L1基因片段及從HSV中擴(kuò)增出gD基因片段作為目的基因,并將目的基因插入到pBV220原核表達(dá)載體中;為了獲得pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD重組蛋白,故將上述重組載體在E.coli DH5α中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)、蛋白純化及其鑒定,以期為研制宮頸癌預(yù)防性疫苗奠定基礎(chǔ)。 方法 重組質(zhì)粒pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD轉(zhuǎn)化E.coil DH5α,溫控誘導(dǎo),以包涵體形式獲高效表達(dá)。在超聲液中加入終濃度為2mol/L的尿素分離洗滌包涵體,然后將其溶于8mol/L尿素中,用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度。將一定量的目的蛋白與免疫佐劑混合后免疫家兔。免疫方式采用皮下多點(diǎn)注射,經(jīng)7次免疫后,取兔耳緣靜脈血行雙向瓊脂免疫擴(kuò)散法檢測(cè)抗體滴度,滴度合適后,進(jìn)行心臟采血。采集分離的血清進(jìn)行雙向瓊脂免疫擴(kuò)散,此外,用Western-blot檢測(cè)和鑒定pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD目的蛋白。 結(jié)果 1、將重組質(zhì)粒pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α,分別經(jīng)42℃誘導(dǎo)表達(dá)6小時(shí)和5小時(shí),成功表達(dá)了相應(yīng)的pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD重組蛋白。SDS-PAGE分析表明:兩者均以包涵體形式存在,pBV220-HPVL1重組蛋白的分子量約為64KD,pBV220-HSVgD重組蛋白的分子量約為13KD。 2、將包涵體超聲裂解、分離洗滌后,獲得了較純的目的蛋白,經(jīng)8M尿素處理后,紫外吸收法測(cè)定HPVL1與HSVgD蛋白濃度分別為5.9mg/ml與4.6mg/ml。 3、以pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD重組蛋白分別免疫家兔,制備了抗HPVL1、HSVgD多克隆抗體,以重組蛋白為抗原,用雙向瓊脂免疫擴(kuò)散法檢測(cè)HPVL1、HSVgD抗血清的效價(jià)均達(dá)到1:16,且HPVL1、HSVgD抗體與免疫原之間形成單一沉淀線,表明所制備的多抗具有良好的純度。 4、免疫印跡分析HPVL1抗血清在分子量約64KD,HSVgD抗血清在分子量約13KD處與相應(yīng)的原核表達(dá)蛋白呈現(xiàn)特異性結(jié)合條帶,表明所表達(dá)的蛋白均為目的蛋白。 結(jié)論 應(yīng)用基因工程技術(shù),將重組質(zhì)粒pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α,成功地高效表達(dá)了pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD重組蛋白。經(jīng)免疫家兔獲得的抗HPVL1和抗HSVgD兩種多克隆抗體都具有良好的特異性和較高的抗體效價(jià),為進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

樣 用加樣器吸取樣品，分別加入小孔內(nèi)，以內(nèi)加入抗原（HPVL1 蛋白/HSVgD 蛋白），周圍各依次稀釋成 1:2，，1:4，1:8，1:16，1:32，1:64 清/兔抗 HSVgD 蛋白血清）。育擴(kuò)散 將載玻片平放于濕盒內(nèi)，置 37℃恒溫淀線的血清最高稀釋倍數(shù)為其抗體效價(jià)。果白濃度的測(cè)定馬斯亮藍(lán)法測(cè)定各管的吸光度值，見表 2-3。Tab2-3 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定各管的號(hào) 1 2 3 4 測(cè)5950.076 0.137 0.264 0.587 度（ug/ml) 200 300 500 1000 作測(cè)定蛋白濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖 2-1
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R392;R737.33

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2583230