【摘要】： 目的 NK細(xì)胞作為機(jī)體固有免疫的重要組成部分是機(jī)體抗腫瘤、抗感染的第一道天然防線。其殺傷功能的出現(xiàn)不需要預(yù)先刺激或致敏,無(wú)MHC(組織相容性復(fù)合物)限制性。NK細(xì)胞不僅能夠介導(dǎo)對(duì)腫瘤細(xì)胞的天然殺傷作用,還能夠調(diào)節(jié)特異性和非特異性免疫應(yīng)答。過(guò)繼轉(zhuǎn)輸活化的或同種異體的NK細(xì)胞,已經(jīng)應(yīng)用于白血病和某些實(shí)體腫瘤的治療中。 白細(xì)胞介素-15(IL-15)由多種組織和細(xì)胞亞群產(chǎn)生,與IL-2在功能上有許多相似之處,可以誘導(dǎo)CD34+的細(xì)胞分化為NK細(xì)胞,并且能夠促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖,增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷活性。我們已經(jīng)建立了IL-15基因修飾的NK-92細(xì)胞系,證實(shí)IL-15的基因修飾能夠增強(qiáng)NK-92細(xì)胞對(duì)多種腫瘤的殺傷能力。 與NK-92細(xì)胞相比,NKL細(xì)胞有著不同的殺傷譜,比如,NKL對(duì)于人胃癌細(xì)胞系SGC7901的殺傷能力強(qiáng)于NK-92細(xì)胞,因此可以作為NK-92的重要補(bǔ)充。NKL細(xì)胞系由Robertson等建立,來(lái)源于CD3-CD16+CD56+的大顆粒淋巴細(xì)胞白血病患者的外周血。NKL依賴于IL-2生長(zhǎng),具自然殺傷活性和ADCC效應(yīng),其增殖反應(yīng)也與正常的CD16+CD56dim NK細(xì)胞相似。NKL是NK細(xì)胞系中與原始NK細(xì)胞最為相近的,因此成為過(guò)繼免疫治療的又一重要選擇。 本文建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hIL-15的NKL細(xì)胞系,證明IL-15基因修飾的NKL細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖、抗凋亡和對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷作用,并初步探討了其分子機(jī)制。 方法 1.電轉(zhuǎn)將IL-15基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入NKL細(xì)胞系。 2.CTLL-2增殖分析測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-15的生物學(xué)活性。 3.酶聯(lián)免疫吸附分析測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-15的濃度。 4.RT-PCR檢測(cè)三種NKL細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因和殺傷相關(guān)基因的表達(dá)水平。 5.CCK方法用于分析三種NKL細(xì)胞在不同濃度IL-2和IL-15條件下的增殖水平。 6.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)三種NKL細(xì)胞凋亡、周期以及膜表面NKG2D和NKG2A分子的表達(dá)。 7.MTT方法檢測(cè)三種NKL細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。 結(jié)果 1.建立了穩(wěn)定表達(dá)人IL-15的基因修飾NKL-IL15細(xì)胞系。 2.IL-15基因修飾的NKL細(xì)胞在低劑量IL-2和IL-15條件下具有更強(qiáng)的增殖活性。 3.IL-15基因提高NKL細(xì)胞系的抗凋亡作用。 4.IL-15的基因上調(diào)NKL細(xì)胞系中抗凋亡基因的表達(dá)。 5.IL-15基因?qū)KL細(xì)胞系的細(xì)胞周期沒(méi)有明顯影響。 6.IL-15基因修飾的NKL細(xì)胞在體外對(duì)肝癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷活性。 7.IL-15基因上調(diào)NKL細(xì)胞殺傷相關(guān)分子的表達(dá)。 8.IL-15基因修飾的NKL細(xì)胞在體內(nèi)能夠有效抑制肝癌細(xì)胞的增殖。 結(jié)論 NK細(xì)胞作為固有免疫的重要組成部分,是抵御病毒感染和腫瘤細(xì)胞的第一道防線,由于無(wú)需抗原預(yù)先作用,就可直接殺傷腫瘤和病毒感染的靶細(xì)胞,因此,在腫瘤免疫監(jiān)視和早期抗感染免疫過(guò)程中起重要作用。應(yīng)用NK細(xì)胞系成為腫瘤生物治療的重要手段,其中NK-92細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)入期臨床試驗(yàn)。為了克服NK細(xì)胞系在應(yīng)用中的某些不足,基因修飾已經(jīng)成為增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷活性的主要手段。迄今為止,已有IL-2,IL-15,SCF,CD20等多種基因用于修飾NK-92細(xì)胞,取得重要進(jìn)展。 為了獲得臨床應(yīng)用的NK細(xì)胞株,我們成功建立了IL-15基因修飾的NKL細(xì)胞株,IL-15基因修飾的NKL細(xì)胞株在低劑量IL-2和IL-15條件下表現(xiàn)出更強(qiáng)的增殖能力,并且在無(wú)血清饑餓狀態(tài)下表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗凋亡作用。進(jìn)一步研究表明,在IL-15基因修飾的NKL細(xì)胞中,抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1表達(dá)水平顯著升高,凋亡基因Bim、Noxa、Fas的表達(dá)水平則降低。更為重要的是NKL-IL-15細(xì)胞不僅在體外能夠有效殺傷肝癌細(xì)胞HepG2、H7402、PLC/PRF-5,亦能顯著增強(qiáng)體內(nèi)對(duì)裸鼠人肝癌移植瘤的抑制作用。這種抗腫瘤效應(yīng)與NKL-IL15細(xì)胞IFN-γ、FasL和Perforin基因的表達(dá)水平提高相關(guān)。因此,人IL-15基因修飾的NKL細(xì)胞的生物學(xué)特征更有利于臨床過(guò)繼免疫治療的應(yīng)用。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 董陸佳;KIR基因與異基因造血細(xì)胞移植[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2004年01期

2 李曉紅;高春記;;異基因造血干細(xì)胞移植中NK細(xì)胞的作用[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2006年04期

3 張建,張建華,許曉群,馮進(jìn)波,孫lm,田志剛;人SCF基因轉(zhuǎn)染NK細(xì)胞系的生物學(xué)特性研究[J];中國(guó)腫瘤生物治療雜志;2003年01期

，

本文編號(hào)：2583135