【摘要】： 免疫抑制劑是一類在腫瘤化療、器官移植、免疫病理學(xué)和臨床免疫學(xué)等多學(xué)科研究基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新的藥劑類別,具有免疫抑制作用,可抑制機體異常的免疫反應(yīng),目前廣泛應(yīng)用于器官移植抗排斥反應(yīng)和自身免疫性疾病的治療。此類藥物已經(jīng)歷了將近百年發(fā)展,已經(jīng)有很多應(yīng)用于臨床,并取得了巨大的經(jīng)濟和社會效益。研發(fā)新的副作用輕、效果好的免疫抑制劑具有應(yīng)用價值。 中藥作為藥物研發(fā)的寶庫,其發(fā)揮療效的主要途徑是對免疫功能的調(diào)節(jié)作用,其中,具有免疫抑制作用的中藥很可能含有具有明確藥理作用和開發(fā)應(yīng)用前景的單體,本校藥學(xué)院張衛(wèi)東教授課題組分離獲得了數(shù)千種中藥化學(xué)單體成分,本課題組與之合作,從中篩選出多種對于免疫功能具有調(diào)控作用的單體成分。其中,一種對于樹突狀細(xì)胞(dendritic cells, DCs)的功能具有調(diào)控作用的單體MD3引起了我們的興趣。樹突狀細(xì)胞是體內(nèi)功能最強大的抗原提呈細(xì)胞,在免疫應(yīng)答與免疫耐受中發(fā)揮著重要的作用。近年來,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)免疫抑制性藥物對免疫功能的抑制作用和其對于DCs功能的調(diào)節(jié)有關(guān)。本課題重點分析了中藥單體MD3對DCs發(fā)育分化和功能的影響,并初步分析了其作用的機制。 一、中藥單體MD3對樹突狀細(xì)胞分化發(fā)育的影響 為了分析MD3對DCs發(fā)育分化的影響,我們首先應(yīng)用不同濃度(0、0.4、4、20、40、80μmol/ml)的MD3處理DCs并檢測了其分化發(fā)育的情況。正常培養(yǎng)DCs 3天換液時,加入不同濃度的藥物MD3,繼續(xù)作用72小時候,進行一系列觀察和檢測。首先,進行形態(tài)學(xué)方面的觀察,在顯微鏡下觀察可見,在0-0.4μmol/m的濃度范圍之內(nèi),藥物MD3并不顯著影響DCs的增殖,在低倍鏡下觀察,DCs的集落的數(shù)量、形態(tài)、大小沒有顯著的差異。而在20μmol/ml的濃度時,DCs的集落形態(tài)明顯變小,數(shù)量上差異特別明顯。在40-80μmol/ml的濃度時,幾乎看不到集落的形成。收集經(jīng)過同樣處理的DCs,進行了細(xì)胞凋亡的研究,在以Annexin-v、7-AAD和Rho123標(biāo)記后,結(jié)果顯示,藥物MD3在藥理濃度(0-0.4μmo/ml)范圍內(nèi),并不顯著抑制DCs的增殖。以小鼠DCs的典型標(biāo)志CD11c標(biāo)記小鼠,并以7-AAD去除死細(xì)胞,來觀察藥物處理的DCs的純度,結(jié)果顯示,在藥理濃度范圍內(nèi),MD3并不影響DCs的分化,僅在較高濃度和高濃度時,DCs的分化能力降低。同時,我們以4μmo/ml MD3處理正常培養(yǎng)3天的DCs,繼續(xù)培養(yǎng)3天后,觀察DCs表型的變化,結(jié)果顯示,藥物處理后的DCs的表型并沒有變化,這也提示MD3并不影響DCs的分化發(fā)育。我們還觀察了不同時間點加入藥物后,DCs的增殖況,結(jié)果顯示,不同時間處理的DCs也沒有顯著的差異。 總之, MD3對DCs的分化發(fā)育并沒有顯著的影響。但超過藥理濃度的MD3對于DCs具有明顯的促凋亡作用,表明對于該單體的結(jié)構(gòu)可能還需要進一步改造以減輕其毒副作用。 二、中藥單體MD3對樹突狀細(xì)胞功能的影響及其作用機制 DCs的主要功能包括吞噬功能、細(xì)胞因子的分泌功能、遷移能力以及抗原處理和提呈功能等。在本部分研究中,我們就MD3對于DCs功能的調(diào)節(jié)作用展開了研究。首先,觀察了MD3對DCs吞噬能力的影響,結(jié)果顯示,MD3對未成熟和成熟DCs的吞噬能力都沒有顯著的影響。我們也檢測了MD3處理后經(jīng)LPS刺激的成熟DCs的表型,結(jié)果顯示沒有明顯的變化。在細(xì)胞因子的分泌方面,我們觀察到MD3處理后的DCs的IL-10分泌增高,TNF-α和IL-12P70的表達沒有明顯的變化。DCs的遷移能力對于體內(nèi)DCs的生物學(xué)功能的發(fā)揮也有重要的作用。在體外的趨化實驗中,我們發(fā)現(xiàn)MD3可以抑制MIp-1α對未成熟DCs的趨化,而對MIp-3β對成熟的DCs的趨化能力沒有影響。我們也對其機制進行了一些研究,結(jié)果顯示,其顯著降低未成熟DCs表面的趨化性受體的表達,而在成熟DCs趨化性受體CCR7的表達沒有顯著影響。此外,我們也觀察了MD3處理的經(jīng)LPS刺激的DCs誘導(dǎo)同種異體T淋巴細(xì)胞和特異性T淋巴細(xì)胞增殖的能力,結(jié)果顯示,MD3對此均具有一定的抑制作用。 綜上所述,本研究結(jié)果顯示中藥單體MD3對DCs分化發(fā)育沒有顯著影響,但是可以顯著影響未成熟樹突狀細(xì)胞的趨化并促進成熟DCs分泌IL-10。這兩方面的功能都表明MD3很可能具有開發(fā)和應(yīng)用的前景。對于MD3作用的信號機制以及在體內(nèi)是否具有免疫抑制作用,還需要進一步研究。
【圖文】：

圖 1.1. 顯微鏡下觀察不同濃度的 MD3 對小鼠骨髓來源的未成熟 DCs 的影響Figure 1.1 The influnence of murine BMDCs treated with MD3 obersvered atdifferent concentrations by light microscopyOn day 3, DCs cultured in GM-CSF and IL-4 were treated with differentconcentrations of MD3, as indicated, for 72 hours. On day 6, cells were photographed bylight microscopy. Data represent one of at least three independent experiments withsimilar results.（二）藥理濃度的 MD3 不誘導(dǎo) DCs 前體的凋亡為了觀察藥理濃度（0.4-4μmol/ml）的 MD3 對分化過程中的 BMDCs 是否具有促凋亡作用，我們在 DCs 前體培養(yǎng)的第三天，加入不同的濃度（0.4-80μmol/ml）的 MD3，繼續(xù)培養(yǎng) 72 小時后，收集細(xì)胞，以 Annexin V+ 7AAD+和 Rho123 兩種方法標(biāo)記細(xì)胞并經(jīng)流式細(xì)胞分析，結(jié)果表明，在 MD3 加入后，，在較高的藥物濃度

. A.藥理濃度的 MD3 并不影響 DCs 的分化1.3. A ． The differentiation of murine BMDCs treated wons of MD3.y 3, DCs cultured in GM-CSF and IL-4 were treated wons of MD3, as indicated, for 72 hours. On day 6, DCs were hCs were evaluated by CD11c+ lable number and ratio of celent one of at least three independent experiments with similar re時檢測了在4μmol/ml的藥物濃度時，MD3對未成熟DCs的表 DCs 的第三天，藥物 MD3 以 4μmol/ml 的濃度被加入，繼續(xù)，流式檢測藥物 MD3 處理和沒有處理的未成熟 DCs 的表型CD40 。我們發(fā)現(xiàn)在 4μmol/mL 濃度的 MD3 處理并不顯著影
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R392

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本文編號：2583073