【摘要】： 免疫抑制劑是一類在腫瘤化療、器官移植、免疫病理學(xué)和臨床免疫學(xué)等多學(xué)科研究基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新的藥劑類別,具有免疫抑制作用,可抑制機(jī)體異常的免疫反應(yīng),目前廣泛應(yīng)用于器官移植抗排斥反應(yīng)和自身免疫性疾病的治療。此類藥物已經(jīng)歷了將近百年發(fā)展,已經(jīng)有很多應(yīng)用于臨床,并取得了巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。研發(fā)新的副作用輕、效果好的免疫抑制劑具有應(yīng)用價(jià)值。 中藥作為藥物研發(fā)的寶庫(kù),其發(fā)揮療效的主要途徑是對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)作用,其中,具有免疫抑制作用的中藥很可能含有具有明確藥理作用和開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景的單體,本校藥學(xué)院張衛(wèi)東教授課題組分離獲得了數(shù)千種中藥化學(xué)單體成分,本課題組與之合作,從中篩選出多種對(duì)于免疫功能具有調(diào)控作用的單體成分。其中,一種對(duì)于樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells, DCs)的功能具有調(diào)控作用的單體MD3引起了我們的興趣。樹(shù)突狀細(xì)胞是體內(nèi)功能最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞,在免疫應(yīng)答與免疫耐受中發(fā)揮著重要的作用。近年來(lái),越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)免疫抑制性藥物對(duì)免疫功能的抑制作用和其對(duì)于DCs功能的調(diào)節(jié)有關(guān)。本課題重點(diǎn)分析了中藥單體MD3對(duì)DCs發(fā)育分化和功能的影響,并初步分析了其作用的機(jī)制。 一、中藥單體MD3對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞分化發(fā)育的影響 為了分析MD3對(duì)DCs發(fā)育分化的影響,我們首先應(yīng)用不同濃度(0、0.4、4、20、40、80μmol/ml)的MD3處理DCs并檢測(cè)了其分化發(fā)育的情況。正常培養(yǎng)DCs 3天換液時(shí),加入不同濃度的藥物MD3,繼續(xù)作用72小時(shí)候,進(jìn)行一系列觀察和檢測(cè)。首先,進(jìn)行形態(tài)學(xué)方面的觀察,在顯微鏡下觀察可見(jiàn),在0-0.4μmol/m的濃度范圍之內(nèi),藥物MD3并不顯著影響DCs的增殖,在低倍鏡下觀察,DCs的集落的數(shù)量、形態(tài)、大小沒(méi)有顯著的差異。而在20μmol/ml的濃度時(shí),DCs的集落形態(tài)明顯變小,數(shù)量上差異特別明顯。在40-80μmol/ml的濃度時(shí),幾乎看不到集落的形成。收集經(jīng)過(guò)同樣處理的DCs,進(jìn)行了細(xì)胞凋亡的研究,在以Annexin-v、7-AAD和Rho123標(biāo)記后,結(jié)果顯示,藥物MD3在藥理濃度(0-0.4μmo/ml)范圍內(nèi),并不顯著抑制DCs的增殖。以小鼠DCs的典型標(biāo)志CD11c標(biāo)記小鼠,并以7-AAD去除死細(xì)胞,來(lái)觀察藥物處理的DCs的純度,結(jié)果顯示,在藥理濃度范圍內(nèi),MD3并不影響DCs的分化,僅在較高濃度和高濃度時(shí),DCs的分化能力降低。同時(shí),我們以4μmo/ml MD3處理正常培養(yǎng)3天的DCs,繼續(xù)培養(yǎng)3天后,觀察DCs表型的變化,結(jié)果顯示,藥物處理后的DCs的表型并沒(méi)有變化,這也提示MD3并不影響DCs的分化發(fā)育。我們還觀察了不同時(shí)間點(diǎn)加入藥物后,DCs的增殖況,結(jié)果顯示,不同時(shí)間處理的DCs也沒(méi)有顯著的差異。 總之, MD3對(duì)DCs的分化發(fā)育并沒(méi)有顯著的影響。但超過(guò)藥理濃度的MD3對(duì)于DCs具有明顯的促凋亡作用,表明對(duì)于該單體的結(jié)構(gòu)可能還需要進(jìn)一步改造以減輕其毒副作用。 二、中藥單體MD3對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞功能的影響及其作用機(jī)制 DCs的主要功能包括吞噬功能、細(xì)胞因子的分泌功能、遷移能力以及抗原處理和提呈功能等。在本部分研究中,我們就MD3對(duì)于DCs功能的調(diào)節(jié)作用展開(kāi)了研究。首先,觀察了MD3對(duì)DCs吞噬能力的影響,結(jié)果顯示,MD3對(duì)未成熟和成熟DCs的吞噬能力都沒(méi)有顯著的影響。我們也檢測(cè)了MD3處理后經(jīng)LPS刺激的成熟DCs的表型,結(jié)果顯示沒(méi)有明顯的變化。在細(xì)胞因子的分泌方面,我們觀察到MD3處理后的DCs的IL-10分泌增高,TNF-α和IL-12P70的表達(dá)沒(méi)有明顯的變化。DCs的遷移能力對(duì)于體內(nèi)DCs的生物學(xué)功能的發(fā)揮也有重要的作用。在體外的趨化實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)MD3可以抑制MIp-1α對(duì)未成熟DCs的趨化,而對(duì)MIp-3β對(duì)成熟的DCs的趨化能力沒(méi)有影響。我們也對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了一些研究,結(jié)果顯示,其顯著降低未成熟DCs表面的趨化性受體的表達(dá),而在成熟DCs趨化性受體CCR7的表達(dá)沒(méi)有顯著影響。此外,我們也觀察了MD3處理的經(jīng)LPS刺激的DCs誘導(dǎo)同種異體T淋巴細(xì)胞和特異性T淋巴細(xì)胞增殖的能力,結(jié)果顯示,MD3對(duì)此均具有一定的抑制作用。 綜上所述,本研究結(jié)果顯示中藥單體MD3對(duì)DCs分化發(fā)育沒(méi)有顯著影響,但是可以顯著影響未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的趨化并促進(jìn)成熟DCs分泌IL-10。這兩方面的功能都表明MD3很可能具有開(kāi)發(fā)和應(yīng)用的前景。對(duì)于MD3作用的信號(hào)機(jī)制以及在體內(nèi)是否具有免疫抑制作用,還需要進(jìn)一步研究。
【圖文】：

圖 1.1. 顯微鏡下觀察不同濃度的 MD3 對(duì)小鼠骨髓來(lái)源的未成熟 DCs 的影響Figure 1.1 The influnence of murine BMDCs treated with MD3 obersvered atdifferent concentrations by light microscopyOn day 3, DCs cultured in GM-CSF and IL-4 were treated with differentconcentrations of MD3, as indicated, for 72 hours. On day 6, cells were photographed bylight microscopy. Data represent one of at least three independent experiments withsimilar results.（二）藥理濃度的 MD3 不誘導(dǎo) DCs 前體的凋亡為了觀察藥理濃度（0.4-4μmol/ml）的 MD3 對(duì)分化過(guò)程中的 BMDCs 是否具有促凋亡作用，我們?cè)?DCs 前體培養(yǎng)的第三天，加入不同的濃度（0.4-80μmol/ml）的 MD3，繼續(xù)培養(yǎng) 72 小時(shí)后，收集細(xì)胞，以 Annexin V+ 7AAD+和 Rho123 兩種方法標(biāo)記細(xì)胞并經(jīng)流式細(xì)胞分析，結(jié)果表明，在 MD3 加入后，，在較高的藥物濃度

. A.藥理濃度的 MD3 并不影響 DCs 的分化1.3. A ． The differentiation of murine BMDCs treated wons of MD3.y 3, DCs cultured in GM-CSF and IL-4 were treated wons of MD3, as indicated, for 72 hours. On day 6, DCs were hCs were evaluated by CD11c+ lable number and ratio of celent one of at least three independent experiments with similar re時(shí)檢測(cè)了在4μmol/ml的藥物濃度時(shí)，MD3對(duì)未成熟DCs的表 DCs 的第三天，藥物 MD3 以 4μmol/ml 的濃度被加入，繼續(xù)，流式檢測(cè)藥物 MD3 處理和沒(méi)有處理的未成熟 DCs 的表型CD40 。我們發(fā)現(xiàn)在 4μmol/mL 濃度的 MD3 處理并不顯著影
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2583073