【摘要】： 顱腦創(chuàng)傷(traumatic brain injury, TBI)是一種致死率和致殘率都很高的疾病,給人類個(gè)體、家庭乃至整個(gè)社會(huì)都帶來了許多的負(fù)擔(dān)。對于顱腦創(chuàng)傷的治療,人們一直致力于對損傷腦組織保護(hù)的研究,以減輕原發(fā)性和繼發(fā)性腦損傷。 利用干細(xì)胞治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷,是目前學(xué)術(shù)界廣泛關(guān)注的神經(jīng)損傷治療新策略,它為顱腦創(chuàng)傷后的神經(jīng)修復(fù)治療帶來了新的曙光。目前研究的重點(diǎn)為調(diào)控干細(xì)胞治療的安全性和有效性。近年來,研究人員發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal cell, BMSC)是一種優(yōu)秀的載體細(xì)胞,它取自自體骨髓,取材方便,且體外易培養(yǎng),增殖快。并且由于來源于自體,BMSCs免疫原性較弱,能夠抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng),由它誘導(dǎo)而來的組織在進(jìn)行移植時(shí)不存在組織配型及免疫排斥等問題,亦不涉及倫理道德問題,因此通過體外培養(yǎng)擴(kuò)增后的BMSCs是組織工程中理想的種子細(xì)胞。它在體內(nèi)或體外誘導(dǎo)條件下可以向神經(jīng)元方向轉(zhuǎn)化,也可以分泌神經(jīng)生長因子,如神經(jīng)生長因子(neural growth factor, NGF)、腦源性神經(jīng)生長因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)等,從而發(fā)揮對損傷神經(jīng)組織的修復(fù)作用。但BMSC也會(huì)因其生存周期短且不穩(wěn)定而影響其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能。 本研究通過比較,篩選出腦創(chuàng)傷修復(fù)相關(guān)基因腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)；進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)染陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的外源性端粒酶表達(dá),使BMSC永生化,獲得了hTERT調(diào)控的的永生化大鼠BMSC,避免細(xì)胞過早衰老,穩(wěn)定其在體內(nèi)外的生長。我們進(jìn)一步構(gòu)建BDNF高效表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)染Ad5-BDNF至hTERT-BMSC,證明了轉(zhuǎn)染BDNF的永生化BMSC在體外通過高表達(dá)BDNF具有一定的損傷細(xì)胞修復(fù)作用。在此基礎(chǔ)上,還借助大鼠TBI模型和立體定向技術(shù)研究TBI組織內(nèi)該細(xì)胞系統(tǒng)的生物學(xué)特征與轉(zhuǎn)歸,證明了其在大鼠體內(nèi)的安全性和對TBI治療的有效性,為BMSC治療TBI步入臨床奠定基礎(chǔ)。 本研究分為三個(gè)部分。第一部分研究是通過原代貼壁培養(yǎng)法獲得性狀穩(wěn)定的大鼠BMSCs,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測其表面標(biāo)記抗原,我們進(jìn)一步通過體外誘導(dǎo)的方法檢測rBMSCs的向成骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞和神經(jīng)樣細(xì)胞方向的分化潛能。研究結(jié)果顯示,原代rBMSCs易于提取和體外純化、擴(kuò)增,鑒定其標(biāo)記物符合BMSCs的特征,其在體外能可通過誘導(dǎo)向脂肪樣細(xì)胞、成骨樣細(xì)胞及神經(jīng)元樣細(xì)胞分化,提示其具有多向分化潛能,證實(shí)rBMSCs培養(yǎng)成功。 第二部分研究是通過轉(zhuǎn)染pLXSN質(zhì)粒介導(dǎo)的人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶催化亞單位(human telomerase reverse transcriptase hTERT)來增強(qiáng)BMSCs端粒酶的活性,獲得了Ad5-hTERT調(diào)控的永生化大鼠BMSC,利用ELISA方法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞的端粒酶活性。同時(shí),通過構(gòu)建腺病毒介導(dǎo)的BDNF高效表達(dá)載體Ad5-BDNF,將Ad5-BDNF復(fù)合體轉(zhuǎn)染至hTERT-BMSC,證明了轉(zhuǎn)染BDNF的永生化BMSC在體外具有一定程度的損傷細(xì)胞修復(fù)作用,為Ad5-BDNF-BMSC的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 第三部分研究中我們選取國際上較為普遍采用的大鼠液壓顱腦損傷模型,在1.5-2.0atm條件下制備大鼠中型顱腦創(chuàng)傷模型,同時(shí)借助于立體定向細(xì)胞移植技術(shù),將共轉(zhuǎn)染BDNF和hTERT基因的BMSCs移植到損傷腦組織區(qū),觀察細(xì)胞移植治療后大鼠生存期變化、神經(jīng)損傷評分(neurologic severity score, NSS)的變化以及損傷區(qū)腦組織水腫在核磁共振成像(MRI)的變化,評價(jià)基因修飾的BMSCs在大鼠液壓顱腦創(chuàng)傷模型體內(nèi)的安全性和對TBI治療的有效性,為BDNF和BMSCs聯(lián)合治療TBI步入臨床奠定基礎(chǔ)。 上述研究結(jié)果表明：大鼠BMSCs易于分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增,長期體外培養(yǎng)BMSCs可出現(xiàn)過早老化和過度增殖等生物學(xué)性狀不穩(wěn)定現(xiàn)象；hTERT正以表達(dá)載體pLXSN-S-hTERT轉(zhuǎn)染至大鼠BMSC,可以使BMSC的端粒酶活性增強(qiáng),促進(jìn)BMSCs增殖,并保持在長期傳代培養(yǎng)過程中形狀穩(wěn)定性,是建立BMSCs永生化細(xì)胞系的安全可靠而有效的方法；Ad-BDNF-hTERT-BMSCs在體內(nèi)外可以高表達(dá)BDNF,能夠有效減少受損神經(jīng)元的的凋亡,提高腦損傷大鼠的生存率,并能促進(jìn)其神經(jīng)功能的康復(fù),為BDNF和BMSCs治療TBI步入臨床奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

渦狀排列、折光性強(qiáng)、生長增殖較快。 ABCDE圖1一 2rBMSCs在原代貼壁培養(yǎng)法不同時(shí)間點(diǎn)的形態(tài)學(xué)觀察(、100)A、自骨髓腔沖洗出所有髓內(nèi)細(xì)胞成分，可見大量圓形單個(gè)細(xì)胞。B、培養(yǎng)7天后梭形折光性強(qiáng)的貼壁細(xì)胞逐漸增多，部分細(xì)胞未貼壁。C、D培養(yǎng)14天后貼壁細(xì)胞生長旺盛，呈梭形，匯集成片，，呈鋪路石狀。E、第5代細(xì)胞形態(tài)基本均一，胞體呈梭形，折光性良好，生長旺盛。原代提取培養(yǎng)10一14天后，貼壁細(xì)胞接近90%匯合，1:2傳代，之后每隔4~5天1:2傳代。第2~4代的貼壁細(xì)胞成分依然復(fù)雜

渦狀排列、折光性強(qiáng)、生長增殖較快。 ABCDE圖1一 2rBMSCs在原代貼壁培養(yǎng)法不同時(shí)間點(diǎn)的形態(tài)學(xué)觀察(、100)A、自骨髓腔沖洗出所有髓內(nèi)細(xì)胞成分，可見大量圓形單個(gè)細(xì)胞。B、培養(yǎng)7天后梭形折光性強(qiáng)的貼壁細(xì)胞逐漸增多，部分細(xì)胞未貼壁。C、D培養(yǎng)14天后貼壁細(xì)胞生長旺盛，呈梭形，匯集成片，呈鋪路石狀。E、第5代細(xì)胞形態(tài)基本均一，胞體呈梭形，折光性良好，生長旺盛。原代提取培養(yǎng)10一14天后，貼壁細(xì)胞接近90%匯合，1:2傳代，之后每隔4~5天1:2傳代。第2~4代的貼壁細(xì)胞成分依然復(fù)雜
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 胡靜波;周燕;蔣丹丹;譚文松;;體外擴(kuò)增過程中人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖與分化規(guī)律[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2006年01期

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本文編號：2582957