【摘要】： 目的: 研究原癌基因pokemon在HepG2細(xì)胞中對細(xì)胞周期蛋白依耐性激酶CDK2基因表達(dá)的調(diào)控作用。 方法: 1.構(gòu)建不同長度的CDK2啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因載體,分別轉(zhuǎn)染到HepG-2中,通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測法檢測pokemon對CDK2啟動(dòng)子活性的影響。 2.染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)pokemon蛋白與CDK2啟動(dòng)子相互作用的關(guān)系。 3.點(diǎn)突變技術(shù)確定pokemon與CDK2啟動(dòng)子結(jié)合的可能位點(diǎn)。 4.Real-Time PCR技術(shù)檢測pokemon對CDK2 mRNA表達(dá)的影響。 5.Westernblot技術(shù)檢測pokemon對CDK2蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果: 1.雙熒光素酶報(bào)告基因顯示: CDK2基因ATG上游528bp為CDK2啟動(dòng)子的核心活性區(qū)域,pokemon在HepG2細(xì)胞抑制了CDK2啟動(dòng)子活性。 2.染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)顯示:細(xì)胞內(nèi)pokemon可通過直接結(jié)合CDK2啟動(dòng)子來調(diào)控CDK2的表達(dá)。 3.點(diǎn)突變技術(shù)顯示:-259 bp至-249bp可能是pokemon與CDK2啟動(dòng)子結(jié)合的序列。 4. RealTime-PCR顯示: pokemon可下調(diào)HepG2細(xì)胞中CDK2 mRNA表達(dá)水平。 5.Westernblot顯示:pokemon可降低HepG2細(xì)胞中CDK2蛋白表達(dá)水平。 結(jié)論: 1.在HepG2細(xì)胞內(nèi)pokemon可通過直接與CDK2啟動(dòng)子的結(jié)合調(diào)控CDK2啟動(dòng)子活性, -259 bp至-249bp可能是pokemon在CDK2啟動(dòng)子上的重要調(diào)控元件; 2.在肝癌細(xì)胞HpG2中pokemon可下調(diào)CDK2 mRNA水平,可降低CDK2蛋白表達(dá)。
【圖文】：

結(jié) 果啟動(dòng)子重組載體的構(gòu)建pG2 細(xì)胞基因組 DNA 為模板，，擴(kuò)增出不同片段長度 CDK2 啟動(dòng)結(jié)果如圖 1、2，經(jīng)過酶切連接轉(zhuǎn)化電泳鑒定得到重組子如圖 3、的 2 號、5 號及圖 4 的 1、2 號均經(jīng)上海英俊生物技術(shù)有限公司 CDK2-528、CDK2-1046 重組子。圖 3 示酶切后在 4242bp 和 5兩條帶，分別代表載體與 CDK2-528bpDNA 片段。而如圖 4 在 附近也顯示兩條帶，分別代表載體與 CDK2-1046DNA 片段。M80150M

的 2 號、5 號及圖 4 的 1、2 號均經(jīng)上海英俊生物技術(shù)有限公司測序 CDK2-528、CDK2-1046 重組子。圖 3 示酶切后在 4242bp 和 528b兩條帶，分別代表載體與 CDK2-528bpDNA 片段。而如圖 4 在 424p 附近也顯示兩條帶，分別代表載體與 CDK2-1046DNA 片段。M2-528PCR 產(chǎn)物電泳圖； 圖 2 :CDK2-1046 PCR 產(chǎn)物電泳圖0bp00bp50bp00bp50bp00bp8000bp2500bp8000bp5000bp15000bp500bp1000bM 1 2 3 4 5MM 1 215000bp528bp1046bp
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R346

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本文編號：2582589