發(fā)布時間：2020-02-24 10:08

【摘要】：尋找胚胎干細(xì)胞以及胚胎干細(xì)胞分化得到的細(xì)胞系的特異性標(biāo)志物一直是干細(xì)胞研究領(lǐng)域的熱點問題。由于干細(xì)胞保持自我更新和分化的信號通路尚未完全闡明,體內(nèi)分化過程無法在體外培養(yǎng)模型中重現(xiàn),專一的針對胚胎干細(xì)胞及其分化細(xì)胞系標(biāo)志物的缺乏,影響了干細(xì)胞及其分化細(xì)胞系在臨床中的應(yīng)用。 本研究通過培養(yǎng)并定向誘導(dǎo)獼猴胚胎干細(xì)胞,利用檢測胚胎干細(xì)胞關(guān)鍵基因OCT4,Nanog,SOX2的表達(dá)情況以及堿性磷酸酶(AKP)的檢測來鑒定胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)狀態(tài);并用懸浮培養(yǎng)和RA+B27誘導(dǎo)的方法來定向誘導(dǎo)獼猴胚胎干細(xì)胞使其向神經(jīng)干細(xì)胞方向分化。利用免疫熒光檢測和RT-PCR檢測神經(jīng)干細(xì)胞關(guān)鍵基因Nestin, SOX2, Mushashi-1的表達(dá)來鑒定神經(jīng)干細(xì)胞。并通過用差異酶處理法獲得相對比較純的神經(jīng)干細(xì)胞。 利用噬菌體展示庫PH.D-12,以及全細(xì)胞懸浮篩選的方法,采用反向/正向的篩選策略,我們獲得獼猴胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)得到的神經(jīng)干細(xì)胞的特異性多肽。通過四輪的篩選,5個特異的肽段被篩選出來。其中HGE多肽是通過全細(xì)胞EILISA檢測選擇的最適合與神經(jīng)干細(xì)胞結(jié)合的肽段。為進(jìn)一步分析所選多肽與神經(jīng)干細(xì)胞的結(jié)合,免疫細(xì)胞化學(xué)ICC以及免疫熒光檢測用于標(biāo)記和檢測展示HGE肽段的噬菌體與細(xì)胞表面的結(jié)合。鑒于檢測的靈敏度,我們利用新型的熒光材料,量子點標(biāo)記技術(shù)與合成的肽段聯(lián)結(jié)。 而另一個與獼猴神經(jīng)干細(xì)胞有很強結(jié)合能力的多肽APW,與獼猴胚胎干細(xì)胞同樣有很強的結(jié)合能力。因此,著重對APW進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和毒性初步分析。通過MTT實驗,PI/Hoechst 33342雙染流式細(xì)胞術(shù),細(xì)胞周期實驗,APW對獼猴胚胎干細(xì)胞沒有明顯的細(xì)胞毒性。生物信息學(xué)分析表明,APW與人類的hCG2045796相似度較高。通過預(yù)測APW三維結(jié)構(gòu)和與獼猴胚胎干細(xì)胞的結(jié)合方式和結(jié)合位點,為進(jìn)一步研究APW的特異性和親和力提供了研究方向。 本研究為將來的神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記,分離,純化,以及信號通路的研究提供了研究基礎(chǔ)。研究中所采用的方法,同樣適用于研究其它的特殊種類的細(xì)胞。
【圖文】：

利用懸浮培養(yǎng)及RA誘導(dǎo)獲得神經(jīng)干細(xì)胞

獼猴胚胎干細(xì)A，傳代到小鼠PMEF上的獼猴ESc；B，，傳傳代5天的ESc；E
【學(xué)位授予單位】：清華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R329

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前9條

1 賀艷萍,郭亞平,馬恩波;小鼠SOX基因的擴增及序列分析[J];動物學(xué)報;2001年S1期

2 郭亞平,賀艷萍,張紅梅,馬恩波;SRY基因及其性別決定[J];動物學(xué)報;2001年S1期

3 張傳生,杜立新;哺乳動物性別決定機理及性別鑒定方法研究進(jìn)展[J];黃牛雜志;2001年03期

4 蔡勇,阿依木古麗,曹斌云;家畜性別決定機制及性別控制的研究進(jìn)展[J];草食家畜;2004年04期

5 張小愛,聶劉旺,張海軍;虎紋蛙四個Sox基因的克隆及序列分析[J];激光生物學(xué)報;2001年04期

6 李美玉,范慶紅;哺乳動物性別決定基因的研究進(jìn)展[J];萊陽農(nóng)學(xué)院學(xué)報;2003年02期

7 余華;葉健強;劉丹;;畜禽性別決定相關(guān)基因的研究進(jìn)展[J];綿陽師范學(xué)院學(xué)報;2009年02期

8 辛?xí)粤?呂長榮;陳冬梅;竇忠英;;牛sox2基因的克隆及重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建[J];生物工程學(xué)報;2009年10期

9 張誼;高等動物性別決定相關(guān)基因的研究進(jìn)展[J];畜禽業(yè);2005年09期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前9條

1 李曉霞;基因重組蛋白誘導(dǎo)多能干細(xì)胞基礎(chǔ)研究[D];暨南大學(xué);2011年

2 辛?xí)粤?特定轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)新生牛成纖維細(xì)胞為多能性干細(xì)胞的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2011年

3 鄭濟芳;揚子鱷（Alligator sinensis）和中華鱉（Trionyx sinensis）的Sox基因研究[D];浙江大學(xué);2003年

4 郭新紅;不同倍性魚類mtDNA及三倍體湘云鯽Sox基因研究[D];湖南師范大學(xué);2004年

5 張偉;文昌魚幾個發(fā)育相關(guān)基因的研究及三崎柱頭蟲的形態(tài)學(xué)觀察[D];山東大學(xué);2006年

6 牛彥鋒;內(nèi)皮素受體B多態(tài)性與SOX10表達(dá)在先天性巨結(jié)腸癥發(fā)病機制中作用研究[D];華中科技大學(xué);2006年

7 楊東;尼羅羅非魚性別決定機制和性別相關(guān)的分子標(biāo)記[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

8 白文林;中國產(chǎn)絨山羊品種父系與母系起源的分子特征及遺傳分化[D];吉林大學(xué);2009年

9 房雪峰;SOX2基因在腫瘤中的作用及其分子機理的研究[D];浙江大學(xué);2010年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 趙賽娟;噬菌體庫篩選小鼠胚胎干細(xì)胞特異結(jié)合多肽[D];清華大學(xué);2010年

2 胡鳳蓉;SOX2對胃癌細(xì)胞惡性表型的影響及機制研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2011年

3 張小愛;虎紋蛙Sox基因的研究[D];安徽師范大學(xué);2002年

4 黃華;SOX10mRNA在先天性巨結(jié)腸腸壁中的表達(dá)及意義[D];鄭州大學(xué);2005年

5 肖海霞;應(yīng)用PCR法和LAMP法鑒定牛早期胚胎性別的研究[D];新疆農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

6 張艷萍;Sry核酸免疫對小鼠性別決定的影響[D];首都師范大學(xué);2006年

7 楊海;家豬精液X、Y精子分離研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2006年

8 孫麗麗;Sry核酸疫苗免疫方式初探[D];首都師范大學(xué);2007年

9 耿聆;5-FU誘發(fā)大鼠離體氣管上皮損傷修復(fù)過程中Nanog表達(dá)及超微結(jié)構(gòu)觀察[D];中國醫(yī)科大學(xué);2007年

10 張衍泉;Sry核酸疫苗作用途徑初探[D];首都師范大學(xué);2008年

本文編號：2582401