【摘要】：尋找胚胎干細(xì)胞以及胚胎干細(xì)胞分化得到的細(xì)胞系的特異性標(biāo)志物一直是干細(xì)胞研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題。由于干細(xì)胞保持自我更新和分化的信號(hào)通路尚未完全闡明,體內(nèi)分化過(guò)程無(wú)法在體外培養(yǎng)模型中重現(xiàn),專一的針對(duì)胚胎干細(xì)胞及其分化細(xì)胞系標(biāo)志物的缺乏,影響了干細(xì)胞及其分化細(xì)胞系在臨床中的應(yīng)用。 本研究通過(guò)培養(yǎng)并定向誘導(dǎo)獼猴胚胎干細(xì)胞,利用檢測(cè)胚胎干細(xì)胞關(guān)鍵基因OCT4,Nanog,SOX2的表達(dá)情況以及堿性磷酸酶(AKP)的檢測(cè)來(lái)鑒定胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)狀態(tài);并用懸浮培養(yǎng)和RA+B27誘導(dǎo)的方法來(lái)定向誘導(dǎo)獼猴胚胎干細(xì)胞使其向神經(jīng)干細(xì)胞方向分化。利用免疫熒光檢測(cè)和RT-PCR檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞關(guān)鍵基因Nestin, SOX2, Mushashi-1的表達(dá)來(lái)鑒定神經(jīng)干細(xì)胞。并通過(guò)用差異酶處理法獲得相對(duì)比較純的神經(jīng)干細(xì)胞。 利用噬菌體展示庫(kù)PH.D-12,以及全細(xì)胞懸浮篩選的方法,采用反向/正向的篩選策略,我們獲得獼猴胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)得到的神經(jīng)干細(xì)胞的特異性多肽。通過(guò)四輪的篩選,5個(gè)特異的肽段被篩選出來(lái)。其中HGE多肽是通過(guò)全細(xì)胞EILISA檢測(cè)選擇的最適合與神經(jīng)干細(xì)胞結(jié)合的肽段。為進(jìn)一步分析所選多肽與神經(jīng)干細(xì)胞的結(jié)合,免疫細(xì)胞化學(xué)ICC以及免疫熒光檢測(cè)用于標(biāo)記和檢測(cè)展示HGE肽段的噬菌體與細(xì)胞表面的結(jié)合。鑒于檢測(cè)的靈敏度,我們利用新型的熒光材料,量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)與合成的肽段聯(lián)結(jié)。 而另一個(gè)與獼猴神經(jīng)干細(xì)胞有很強(qiáng)結(jié)合能力的多肽APW,與獼猴胚胎干細(xì)胞同樣有很強(qiáng)的結(jié)合能力。因此,著重對(duì)APW進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和毒性初步分析。通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn),PI/Hoechst 33342雙染流式細(xì)胞術(shù),細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn),APW對(duì)獼猴胚胎干細(xì)胞沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性。生物信息學(xué)分析表明,APW與人類的hCG2045796相似度較高。通過(guò)預(yù)測(cè)APW三維結(jié)構(gòu)和與獼猴胚胎干細(xì)胞的結(jié)合方式和結(jié)合位點(diǎn),為進(jìn)一步研究APW的特異性和親和力提供了研究方向。 本研究為將來(lái)的神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記,分離,純化,以及信號(hào)通路的研究提供了研究基礎(chǔ)。研究中所采用的方法,同樣適用于研究其它的特殊種類的細(xì)胞。
【圖文】：

利用懸浮培養(yǎng)及RA誘導(dǎo)獲得神經(jīng)干細(xì)胞

獼猴胚胎干細(xì)A，傳代到小鼠PMEF上的獼猴ESc；B，，傳傳代5天的ESc；E
【學(xué)位授予單位】：清華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R329

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2582401