【摘要】： 胚胎早期單管狀心臟流出道連于動(dòng)脈囊和原始心室之間。隨發(fā)育,流出道經(jīng)復(fù)雜的分隔和結(jié)構(gòu)重建,參與心包內(nèi)主、肺動(dòng)脈與所屬動(dòng)脈瓣膜以及左右心室流出道的發(fā)育。有關(guān)不同種屬動(dòng)物胚胎心臟流出道發(fā)育和分隔機(jī)理已有大量研究,但目前尚有許多爭(zhēng)議。探討胚胎早期心臟流出道的正常發(fā)育和分隔機(jī)理可以為流出道發(fā)育和分隔異常導(dǎo)致的先天性心臟病的發(fā)病機(jī)理提供理論依據(jù)。 心臟神經(jīng)嵴是指從耳板中部到第3對(duì)體節(jié)之間的神經(jīng)嵴細(xì)胞,遷移進(jìn)入胚胎心臟,參與主肺動(dòng)脈隔、流出道心內(nèi)膜墊的形成與流出道的分隔。遷移前去除心臟神經(jīng)嵴,可表現(xiàn)為永久性動(dòng)脈干等畸形。因此,有關(guān)神經(jīng)嵴細(xì)胞在流出道的分布與功能成為研究焦點(diǎn)之一,但由于種屬差異和實(shí)驗(yàn)方法不同,對(duì)心臟神經(jīng)嵴在流出道分隔中的作用仍存在分歧。 流出道嵴融合形成間充質(zhì)性流出道隔與其肌性化相伴隨,間充質(zhì)組織肌性化的機(jī)制仍存在爭(zhēng)議。有學(xué)者認(rèn)為流出道壁心肌細(xì)胞不斷向隔內(nèi)生長(zhǎng),同時(shí)募集相鄰間充質(zhì)細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化共同完成流出道隔的肌性化。而本課題組觀察到流出道嵴及其融合形成的流出道隔內(nèi)存在間充質(zhì)細(xì)胞的原位分化。因此,流出道心肌性隔的形成機(jī)制有待進(jìn)一步研究。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、α-橫紋肌肌節(jié)肌動(dòng)蛋白(α-SCA)、肌球蛋白重鏈(MHC)在C10期～C19期人胚心臟的表達(dá)規(guī)律,探討流出道嵴、主肺動(dòng)脈隔的形成與動(dòng)脈囊、心肌性流出道的分隔過(guò)程;闡明α-SMA在流出道心肌與心內(nèi)膜墊內(nèi)的表達(dá)規(guī)律及其意義。通過(guò)觀察胚齡10～14d小鼠胚胎心臟流出道內(nèi)PlexinA2、α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞分布規(guī)律與流出道嵴內(nèi)致密細(xì)胞團(tuán)融合過(guò)程中間充質(zhì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化,探討PlexinA2、α-SMA時(shí)空表達(dá)特點(diǎn)及其對(duì)間充質(zhì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響。通過(guò)觀察胚齡12～16d小鼠胚胎心臟流出道心肌性隔的形成過(guò)程,探討流出道心肌性隔的形成機(jī)制。 第一章人胚早期心臟流出道的分隔 對(duì)32例C10期～C19期[Carnegie stage 10～Carnegie stage 19, Carnegie分期法,排卵后(22±1～47)d]人胚心臟連續(xù)切片,經(jīng)抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、抗α-橫紋肌肌節(jié)肌動(dòng)蛋白(α-sarcomeric actin,α-SCA)、抗肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain, MHC)抗體免疫組織化學(xué)染色,觀察進(jìn)入流出道嵴的α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞的遷移路線(xiàn)、動(dòng)脈囊的演變及其與心肌性流出道的分隔過(guò)程。結(jié)果顯示:人胚C10期～C13期,動(dòng)脈囊位于心包腔外,與心肌性流出道的界限位于流出道與心包腔背側(cè)壁反折處;人胚C14期～C15期,第4弓動(dòng)脈以下的動(dòng)脈囊逐漸降入心包腔內(nèi),動(dòng)脈囊壁心肌化成為流出道的遠(yuǎn)端,使心肌性流出道增長(zhǎng);人胚C16期,第4弓動(dòng)脈水平的動(dòng)脈囊也降入心包腔內(nèi),但未發(fā)生心肌化,動(dòng)脈囊與心肌性流出道界限移至心包腔內(nèi)。人胚C12期～C15期,α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞逐漸在流出道心內(nèi)膜墊聚集,參與形成螺旋狀流出道嵴;C16期,α-SMA陽(yáng)性主肺動(dòng)脈隔形成,流出道嵴縮短。人胚C14期,心包腔外的動(dòng)脈囊分隔。人胚C16期,進(jìn)入心包內(nèi)的動(dòng)脈囊分隔為心包內(nèi)升主動(dòng)脈和肺動(dòng)脈干,心肌性流出道遠(yuǎn)端可見(jiàn)兩動(dòng)脈瓣膜原基,流出道嵴尚未融合。人胚C19期,瓣膜水平流出道嵴開(kāi)始融合形成流出道隔,分隔心肌性流出道,來(lái)自?xún)蓚?cè)嵴內(nèi)α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞在隔中央聚集。由此我們認(rèn)為:流出道嵴的形成早于主肺動(dòng)脈隔的出現(xiàn),流出道嵴的遠(yuǎn)端、近端界限與心肌性流出道的遠(yuǎn)端、近端界限始終保持一致。動(dòng)脈囊首先在心包腔外分隔,進(jìn)入心包腔后由主肺動(dòng)脈隔分隔形成心包內(nèi)升主動(dòng)脈、肺動(dòng)脈干,流出道嵴遠(yuǎn)端形成兩動(dòng)脈瓣膜。流出道嵴大部融合分隔瓣膜以下的心肌性流出道。 第二章人胚早期心臟流出道內(nèi)α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞的發(fā)育 用抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、抗α-橫紋肌肌節(jié)肌動(dòng)蛋白(α-SCA)、抗肌球蛋白重鏈(MHC)抗體對(duì)29例C10期～C16期[Carnegie stage 10～Carnegie stage 16,排卵后(22±1～37)d]人胚心臟連續(xù)切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果顯示:人胚發(fā)育C10期～C13期,與流出道反折處的心包腔背側(cè)壁中胚層上皮細(xì)胞部分呈α-SMA陽(yáng)性,而α-SCA和MHC表達(dá)較弱。提示心包腔背側(cè)壁上皮不斷分化為心肌細(xì)胞添加至流出道遠(yuǎn)端使其增長(zhǎng),這些心肌細(xì)胞α-SMA的表達(dá)早于α-SCA和MHC。人胚C14期～C15期,進(jìn)入心包腔的動(dòng)脈囊壁α-SMA染色為強(qiáng)陽(yáng)性,而α-SCA和MHC僅在左側(cè)壁表達(dá)較強(qiáng)。提示動(dòng)脈囊壁正在心肌化。人胚C12期～C15期,α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞由咽部間充質(zhì)逐漸遷入流出道心內(nèi)膜墊內(nèi),同時(shí)可見(jiàn)流出道心內(nèi)膜的部分內(nèi)皮細(xì)胞由α-SMA陰性轉(zhuǎn)為陽(yáng)性,向間充質(zhì)細(xì)胞分化。不同來(lái)源的間充質(zhì)細(xì)胞在流出道心內(nèi)膜墊內(nèi)聚集,參與形成流出道嵴。隨著α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞不斷進(jìn)入,流出道嵴體積逐漸增大。人胚C16期,流出道嵴縮短,嵴內(nèi)大部分間充質(zhì)細(xì)胞α-SMA表達(dá)減弱,而在流出道嵴近心肌處出現(xiàn)成行排列的α-SMA強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞,相鄰的心肌細(xì)胞伸出突起與其相連。由此我們認(rèn)為:α-SMA可作為心肌細(xì)胞早期分化的標(biāo)志;流出道嵴表面內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞分化時(shí)表達(dá)α-SMA;主肺動(dòng)脈隔與流出道嵴內(nèi)的α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞參與動(dòng)脈囊分隔。 第三章小鼠胚胎心臟流出道嵴的發(fā)育 用抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、抗α-橫紋肌肌節(jié)肌動(dòng)蛋白(α-SCA)單克隆抗體 對(duì)胚齡10～14d小鼠胚胎心臟連續(xù)切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色;用原位雜交方法顯示PlexinA2陽(yáng)性細(xì)胞向胚齡10～14d小鼠胚胎流出道的遷移與分布;透射電鏡觀察胚齡12.5d心臟流出道嵴融合過(guò)程。結(jié)果顯示:胚齡10～11d,神經(jīng)管及其周?chē)?dòng)脈囊和弓動(dòng)脈壁可見(jiàn)PlexinA2陽(yáng)性細(xì)胞,并沿動(dòng)脈囊壁遷入流出道嵴內(nèi),部分細(xì)胞同時(shí)表達(dá)α-SMA。胚齡12d,PlexinA2陽(yáng)性細(xì)胞分布在脊神經(jīng)節(jié)、咽前間充質(zhì)、主肺動(dòng)脈隔以及主、肺動(dòng)脈壁。主肺動(dòng)脈隔顯α-SMA強(qiáng)陽(yáng)性,但動(dòng)脈壁僅見(jiàn)少量α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞。胚齡12.5d,兩側(cè)流出道嵴內(nèi)致密間充質(zhì)細(xì)胞團(tuán)形成,并在瓣膜水平開(kāi)始融合,PlexinA2表達(dá)較弱,α-SMA表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性。在流出道嵴融合開(kāi)始后,嵴表面的內(nèi)皮細(xì)胞帶形成繼而斷裂消失,由含微絲少、排列稀疏的間充質(zhì)細(xì)胞取代。兩側(cè)致密細(xì)胞團(tuán)逐漸靠攏、融合。有的間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)含較多線(xiàn)粒體和微絲,細(xì)胞之間形成細(xì)胞連接點(diǎn);有的間充質(zhì)細(xì)胞含微絲少,細(xì)胞膜間斷融合。還可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞或間充質(zhì)細(xì)胞融合形成雙核細(xì)胞。由上述結(jié)果可得出以下結(jié)論:流出道心內(nèi)膜墊內(nèi)α-SMA陽(yáng)性間充質(zhì)細(xì)胞來(lái)自神經(jīng)嵴;內(nèi)皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化參與流出道嵴融合;致密細(xì)胞團(tuán)內(nèi)間充質(zhì)細(xì)胞富含微絲束和細(xì)胞連接點(diǎn)或發(fā)生細(xì)胞膜局部融合,增加了細(xì)胞之間連接的牢固性,有助于流出道嵴的融合;PlexinA2表達(dá)減弱可能有助于間充質(zhì)細(xì)胞的粘附與聚集。 第四章小鼠胚胎心臟流出道間充質(zhì)隔的肌性化 用抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、抗結(jié)蛋白(Desmin)、抗α-橫紋肌肌節(jié)肌動(dòng)蛋白(α-SCA)單克隆抗體對(duì)胚齡12～16d小鼠胚胎心臟連續(xù)切片進(jìn)行染色。用TUNEL染色對(duì)胚齡13～15d小鼠胚胎心臟切片進(jìn)行染色。結(jié)果顯示:胚齡12d,小鼠胚胎心臟流出道嵴尚未融合,一側(cè)嵴內(nèi)觀察到少量α-SMA、Desmin、α-SCA陽(yáng)性的心肌細(xì)胞,并可見(jiàn)流出道壁心肌細(xì)胞開(kāi)始向嵴內(nèi)延伸。胚齡12.5～14d,動(dòng)脈瓣膜及其以下流出道嵴融合形成間充質(zhì)性流出道隔。流出道壁α-SCA陽(yáng)性的心肌細(xì)胞進(jìn)一步向間充質(zhì)隔內(nèi)長(zhǎng)入。隔中央可見(jiàn)α-SMA、α-SCA陽(yáng)性細(xì)胞獨(dú)立存在。胚齡13～15d,流出道隔中央可見(jiàn)α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞聚集形成漩渦狀結(jié)構(gòu),隔內(nèi)更多間充質(zhì)細(xì)胞由心肌細(xì)胞取代,僅在其中央呈α-SCA陰性。胚齡16d流出道心肌性隔形成。胚齡13～15d,間充質(zhì)隔中央凋亡細(xì)胞逐漸增多。因此我們認(rèn)為:流出道心肌性隔形成的機(jī)制包括心肌化、募集與間充質(zhì)細(xì)胞的原位分化。在此過(guò)程中,部分α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞凋亡;未凋亡的α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞可能原位轉(zhuǎn)分化為心肌細(xì)胞。
【圖文】：

圖 1 人胚 C10 期心臟流出道橫切面。動(dòng)脈囊位于原始咽腹側(cè)，動(dòng)脈囊壁由內(nèi)皮及內(nèi)皮外的少量間充質(zhì)構(gòu)成，免疫組織化學(xué)染色陰性（A，B，E）。流出道位于心包腔內(nèi)，遠(yuǎn)端與動(dòng)脈囊相通，近端與原始心室相連（A）。流出道壁由心肌、心內(nèi)膜及二者之間的心膠質(zhì)構(gòu)成（C），流出道心肌 α-SMA、MHC、α-SCA 染色為陽(yáng)性，由近端向遠(yuǎn)端移行，三種抗體染色逐漸減弱（C~E）。流出道遠(yuǎn)端心肌與心包腔背側(cè)壁上皮相延續(xù)（B 箭頭處）。流出道心膠質(zhì)內(nèi)未見(jiàn)間充質(zhì)細(xì)胞（B~E）。A 示 HA 染色；B，C 示 α-SMA染色；D 示 MHC 染色；E 示 α-SCA 染色。B~D 為 NBT/BCIP 顯色（陽(yáng)性結(jié)果呈深藍(lán)色），E 為 DAB顯色（陽(yáng)性結(jié)果呈棕黃色）。Ph：咽；AS：動(dòng)脈囊；OFT：流出道；PC：心包腔；LV：左心室；e：心內(nèi)膜；m：心肌。A 標(biāo)尺示 200μm；B~E 標(biāo)尺示 100μm

8圖 2 人胚 C11 期心臟流出道橫切面。動(dòng)脈囊仍位于原始咽腹側(cè)間充質(zhì)內(nèi)，其周?chē)拈g充質(zhì)細(xì)胞增加（A 箭頭處）。右心室尚未發(fā)育，流出道近端與原始心室相連（B）。動(dòng)脈囊左側(cè)壁可見(jiàn)第 2 對(duì)弓動(dòng)脈通入動(dòng)脈囊（C）。流出道遠(yuǎn)端心肌 α-SMA、MHC 染色延伸至流出道與心包腔背側(cè)壁反折處（C 箭頭處，D）。流出道心膠質(zhì)內(nèi)未見(jiàn)間充質(zhì)細(xì)胞（A~D）。A，B 示 HA 染色；C 示 α-SMA 染色；D 示 MHC 染色。C，，D 為 NBT/BCIP 顯色。Ph：咽；AS：動(dòng)脈囊；OFT：流出道；LV：左心室；PC：心包腔；A：心房；AA：弓動(dòng)脈。A，B 標(biāo)尺示 200μm；C，D 標(biāo)尺示 100μm
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類(lèi)號(hào)】：R321

【參考文獻(xiàn)】

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1 李海榮;李素云;楊艷萍;劉魚(yú)珍;曹錫梅;劉慧霞;王彤;景雅;;人胚胎早期心臟流出道的發(fā)育[J];解剖學(xué)報(bào);2008年03期

本文編號(hào)：2582382