【摘要】： 多聚免疫球蛋白受體(pIgR)屬于I型跨膜糖蛋白,可以與多聚免疫球蛋白A和多聚免疫球蛋白M特異性結(jié)合,通過穿胞轉(zhuǎn)運,將它們從上皮細胞基底側(cè)膜轉(zhuǎn)運到頂膜,并最終分泌到外分泌液中去。MDCK是狗的腎上腺皮質(zhì)細胞,該細胞株因適合作為上皮生物學(xué)模型而被廣泛應(yīng)用。在組織培養(yǎng)中,MDCK細胞能夠形成上皮致密單層。本課題組前期實驗利用真核轉(zhuǎn)染技術(shù),成功構(gòu)建了人pIgR穩(wěn)定高表達的MDCK細胞株(命名為MDCK-pIgR,陰性對照組細胞命名為MDCK-mock),在研究pIgR的極性轉(zhuǎn)運時意外發(fā)現(xiàn),MDCK-pIgR細胞株的增殖速加快,表型由柱狀變?yōu)槌杉±w維細胞樣,并且,與MDCK-mock組細胞相比,這些細胞的運動性增強。進一步的表明pIgR的表達也許能夠促進EMT的發(fā)生。 本論文采用RNA干擾技術(shù),研究pIgR介導(dǎo)EMT的作用。論文分三部分為內(nèi)容。 第一部分pIgR低表達細胞株的建立。 設(shè)計并合成三種RNA干擾質(zhì)粒,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MDCK-pIgR細胞,采用RT-PCR、Western-Blotting和免疫熒光化學(xué)技術(shù)檢測干擾效率。結(jié)果顯示,RNA干擾效果明顯,可以用于后續(xù)的實驗。 第二部分pIgR介導(dǎo)MDCK細胞EMT的作用研究 觀察干擾組細胞與陰性對照組細胞形態(tài)變化,檢測增殖相關(guān)指標(biāo),觀察RNA干擾前后遷移、侵襲、粘附等細胞行為和軟瓊脂生長能力是否改變。結(jié)果顯示,pIgR使MDCK細胞的形態(tài)發(fā)生顯著變化,細胞的遷移、侵襲能力增強,而粘附力減弱,在軟瓊脂上的生長能力增強。以上結(jié)果說明,pIgR介導(dǎo)了MDCK細胞EMT的發(fā)生。 第三部分pIgR介導(dǎo)EMT的可能分子機制初探 在MDCK細胞模型中,pIgR的穿胞轉(zhuǎn)運機制被廣泛研究。在與配體結(jié)合或二聚化后,pIgR能夠發(fā)生磷酸化。為了找到MDCK-pIgR細胞發(fā)生EMT的機制,我們采用RT-PCR、Western-Blotting等技術(shù)檢測了ERK、Snail、角蛋白、F-actin,并采用IP方法探討pIgR是否能夠發(fā)生磷酸化調(diào)節(jié)細胞信號。推測pIgR介導(dǎo)EMT的可能分子機制為:pIgR的高表達促進ERK1/2磷酸化,上調(diào)Snail,下調(diào)E-鈣粘素的表達,粘附連接破壞,細胞骨架重新排列,從而導(dǎo)致EMT的發(fā)生。而上述過程是由pIgR Tyr的磷酸化引起的。 本論文的研究發(fā)現(xiàn)了pIgR在調(diào)節(jié)EMT中的作用,拓展了pIgR的研究領(lǐng)域。為pIgR的促腫瘤生成作用奠定了基礎(chǔ)。提示pIgR是腫瘤治療中的潛在靶點�；谶M一步的評價,在特殊腫瘤組織中抑制pIgR的表達可能會成為阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移的有效手段。
【圖文】：

圖 2 RNA 干擾質(zhì)粒測序結(jié)果干擾質(zhì)粒大量抽提結(jié)果擾質(zhì)粒大量抽提后進行電泳，結(jié)果表明：三種質(zhì)粒濃度及純度較高，符合胞轉(zhuǎn)染要求。經(jīng)密度掃描確定濃度，決定真核轉(zhuǎn)染實驗的質(zhì)粒用量為20μL/4 孔板，細胞融合度 70-90%）。2000bp10007505004500bp

圖 6 免疫熒光化學(xué)檢測 pIgR 的蛋白質(zhì)表達結(jié)果利用 pIgR 抗體對兩組細胞進行免疫細胞化學(xué)染色，二抗為 CY3 標(biāo)記（紅色熒光）的抗小鼠 IgG。（A）MDCK-mock；（B）MDCK-pIgR：（C）NC；（D）干擾 1；（E）干擾 2；（F）干擾 34 討論本部分實驗的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染采用了 Invitrogen 公司的脂質(zhì)體 LipofectamineTM2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染過程，該試劑具有轉(zhuǎn)染效率高、易于操作、工作濃度下細胞毒性小的優(yōu)點。轉(zhuǎn)染使用的質(zhì)粒 DNA 采用常規(guī)質(zhì)粒大量抽提方法并加以改良，進行了純化處理，，去除了雜蛋白以及具有細胞毒性的酚、氯仿等物質(zhì)。同時，我們延長了脂質(zhì)體-DNA 與細胞共孵育時間，共孵育 6h 后并沒有棄去轉(zhuǎn)染液，而是加入血清
【學(xué)位授予單位】：中國海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

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本文編號：2577830