發(fā)布時間：2020-02-08 23:50

【摘要】： 目的觀察ING4基因在腫瘤發(fā)生中轉錄水平的變化和突變情況;克隆人骨髓間質干細胞ING4(inhibitor of growth famility,member4)基因,改造慢病毒表達載體并構建ING4基因慢病毒表達載體PNL-ING4 方法培養(yǎng)多種腫瘤細胞株,包括肺腺癌細胞株(A549)、宮頸癌細胞株(Hela)、結腸癌細胞株(SW480)、小細胞肺癌細胞株(LTEP-a-2)、前列腺癌細胞株(PC3)、白血病干細胞(LSC)及hMSC來源腫瘤細胞(F6)和胃癌組織中分離的間質干細胞(GC-MSC),以成人骨髓間質干細胞(hBM-MSC)、人臍靜脈內皮細胞(UVEC-304)為對照,收集白血病患者骨髓和胃癌患者癌組織,采用RT-PCR和Real-Time PCR技術研究各種細胞、白血病患者骨髓和胃癌組織中ING4基因的表達水平變化;從hBM-MSC、LSC、SW480、F6和慢性粒細胞白血病骨髓單個核細胞cDNA中克隆ING4基因并測序觀察ING4基因的突變情況;經RT-PCR擴增出hBM-MSC來源的全長ING4cDNA,克隆、鑒定并測序后與重組改造慢病毒表達載體PNL-ires連接,構建慢病毒表達載體PNL-ING4,經雙酶切、基因測序進行鑒定。采用脂質體方法轉染293T細胞,通過RT-PCR檢測ING4基因的表達。 結果RT-PCR表明在LTEP-a-2、SW480、LSC、Hela、PC3、F6、GC-MSC、hBM-MSC、UVEC-304、急性淋巴細胞白血病(ALL)和慢性粒細胞白血病(CML)患者骨髓中有不同水平ING4基因表達,其中LSC、ALL和CML患者骨髓中表達量較低,而在A549和胃癌患者癌組織中表達量極低。定量PCR顯示,ING4基因在A549、LTEP-a-2、SW480、GC-MSC、PC3、Hela、UVEC-304、hBM-MSC和F6中均有表達,表達量以A549最低,F6最高,而UVEC-304和hBM-MSC居中。全長測序顯示,在hBM-MSC第七代和第九代、LSC、SW480、F6、CML患者骨髓中均發(fā)現(xiàn)缺失及錯配,缺失大部分發(fā)生在NLS域內,錯義突變和移碼突變也有發(fā)現(xiàn)。且隨著骨髓間質干細胞傳代數目的增多,點突變和缺失的頻率也越來越高。從hBM-MSC中克隆ING4基因全長并改造慢病毒表達載體PNL-ires,構建了PNL-ING4慢病毒表達載體,雙酶切和基因測序正確。包裝293T細胞后可見綠色熒光,轉染效率可達80%以上,并可檢測出ING4基因的表達。 結論ING4基因在不同腫瘤細胞中呈不同水平的表達,部分表現(xiàn)出表達產物發(fā)生突變。這些因素都是通過改變ING4的表達水平或生物活性,參與腫瘤的發(fā)生,特別值得關注的是,在MSC體外突變致瘤中,ING4表達突變是其中一個重要原因。成功構建ING4慢病毒表達載體PNL-ING4,為研究ING4基因在腫瘤發(fā)生中的作用與腫瘤基因治療奠定基礎。
【圖文】：

圖3.2熒光定量PCR擴增ING4及B一actin基因標準曲線和擴增曲線A、B為ING4基因標準曲線;C、D為B一actin基因標準曲線;E為ING4基因融解曲線;F為B一actin基因融解曲線;G為ING4基因擴增曲線;H為B一actin基因擴增曲線;ING4標準品濃度分別為102、103、一04、B一aetin標準品濃度分別為103、104、105、205、lo6copies恤l:106、一07、loseopies/PI。Fig.3.2StandardeurveandamPlificationcurveofreal一timePCRforING4geneandB一actingeneA、BwerethestandardeurveofING4gene;C、DwerethestandardeurveofB一actingene:EwasdilaPsuseurveofING4gene:FwasdilaPsuseurveofB一actingene;GwasamPlificationeurveofING4gene:HwasamPlificationeurveofB一aetingene:ThestandardsamplesofING4wereloZ、10，、104、10，、lo6eopies扭l:24

圖3.3Real一timePCR測定細胞株中ING4基因表達每個條形柱代表三次獨立實驗的平均值(巧D)Fig.3.3real一timePCRforING4geneEacheolumnrePresentsrhemeanofthreeindividualexperiments(士SD)表3.2各腫瘤細胞株ING4和p一actin拷貝數名稱A549LTEP一a一2SW480GC一MSCPC3HELAUVEC一304hBM58416.9*1049.4*1033*1020.2*1013.8*1051.5*103215*1062.4*10一‘31.7*1046.1189*IOb2.61*10一4160*106233*10b98.9*1061.4*10一4310*1061.02*10一4288tin3.46*10一52.06*10一48.67*10一51.6*
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R346;R730.2

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本文編號：2577645