【摘要】： 目的觀察ING4基因在腫瘤發(fā)生中轉(zhuǎn)錄水平的變化和突變情況;克隆人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞ING4(inhibitor of growth famility,member4)基因,改造慢病毒表達(dá)載體并構(gòu)建ING4基因慢病毒表達(dá)載體PNL-ING4 方法培養(yǎng)多種腫瘤細(xì)胞株,包括肺腺癌細(xì)胞株(A549)、宮頸癌細(xì)胞株(Hela)、結(jié)腸癌細(xì)胞株(SW480)、小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株(LTEP-a-2)、前列腺癌細(xì)胞株(PC3)、白血病干細(xì)胞(LSC)及hMSC來(lái)源腫瘤細(xì)胞(F6)和胃癌組織中分離的間質(zhì)干細(xì)胞(GC-MSC),以成人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(hBM-MSC)、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(UVEC-304)為對(duì)照,收集白血病患者骨髓和胃癌患者癌組織,采用RT-PCR和Real-Time PCR技術(shù)研究各種細(xì)胞、白血病患者骨髓和胃癌組織中ING4基因的表達(dá)水平變化;從hBM-MSC、LSC、SW480、F6和慢性粒細(xì)胞白血病骨髓單個(gè)核細(xì)胞cDNA中克隆ING4基因并測(cè)序觀察ING4基因的突變情況;經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出hBM-MSC來(lái)源的全長(zhǎng)ING4cDNA,克隆、鑒定并測(cè)序后與重組改造慢病毒表達(dá)載體PNL-ires連接,構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體PNL-ING4,經(jīng)雙酶切、基因測(cè)序進(jìn)行鑒定。采用脂質(zhì)體方法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,通過(guò)RT-PCR檢測(cè)ING4基因的表達(dá)。 結(jié)果RT-PCR表明在LTEP-a-2、SW480、LSC、Hela、PC3、F6、GC-MSC、hBM-MSC、UVEC-304、急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)和慢性粒細(xì)胞白血病(CML)患者骨髓中有不同水平ING4基因表達(dá),其中LSC、ALL和CML患者骨髓中表達(dá)量較低,而在A549和胃癌患者癌組織中表達(dá)量極低。定量PCR顯示,ING4基因在A549、LTEP-a-2、SW480、GC-MSC、PC3、Hela、UVEC-304、hBM-MSC和F6中均有表達(dá),表達(dá)量以A549最低,F6最高,而UVEC-304和hBM-MSC居中。全長(zhǎng)測(cè)序顯示,在hBM-MSC第七代和第九代、LSC、SW480、F6、CML患者骨髓中均發(fā)現(xiàn)缺失及錯(cuò)配,缺失大部分發(fā)生在NLS域內(nèi),錯(cuò)義突變和移碼突變也有發(fā)現(xiàn)。且隨著骨髓間質(zhì)干細(xì)胞傳代數(shù)目的增多,點(diǎn)突變和缺失的頻率也越來(lái)越高。從hBM-MSC中克隆ING4基因全長(zhǎng)并改造慢病毒表達(dá)載體PNL-ires,構(gòu)建了PNL-ING4慢病毒表達(dá)載體,雙酶切和基因測(cè)序正確。包裝293T細(xì)胞后可見(jiàn)綠色熒光,轉(zhuǎn)染效率可達(dá)80%以上,并可檢測(cè)出ING4基因的表達(dá)。 結(jié)論ING4基因在不同腫瘤細(xì)胞中呈不同水平的表達(dá),部分表現(xiàn)出表達(dá)產(chǎn)物發(fā)生突變。這些因素都是通過(guò)改變ING4的表達(dá)水平或生物活性,參與腫瘤的發(fā)生,特別值得關(guān)注的是,在MSC體外突變致瘤中,ING4表達(dá)突變是其中一個(gè)重要原因。成功構(gòu)建ING4慢病毒表達(dá)載體PNL-ING4,為研究ING4基因在腫瘤發(fā)生中的作用與腫瘤基因治療奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖3.2熒光定量PCR擴(kuò)增ING4及B一actin基因標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴(kuò)增曲線A、B為ING4基因標(biāo)準(zhǔn)曲線;C、D為B一actin基因標(biāo)準(zhǔn)曲線;E為ING4基因融解曲線;F為B一actin基因融解曲線;G為ING4基因擴(kuò)增曲線;H為B一actin基因擴(kuò)增曲線;ING4標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為102、103、一04、B一aetin標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為103、104、105、205、lo6copies恤l:106、一07、loseopies/PI。Fig.3.2StandardeurveandamPlificationcurveofreal一timePCRforING4geneandB一actingeneA、BwerethestandardeurveofING4gene;C、DwerethestandardeurveofB一actingene:EwasdilaPsuseurveofING4gene:FwasdilaPsuseurveofB一actingene;GwasamPlificationeurveofING4gene:HwasamPlificationeurveofB一aetingene:ThestandardsamplesofING4wereloZ、10，、104、10，、lo6eopies扭l:24

圖3.3Real一timePCR測(cè)定細(xì)胞株中ING4基因表達(dá)每個(gè)條形柱代表三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值(巧D)Fig.3.3real一timePCRforING4geneEacheolumnrePresentsrhemeanofthreeindividualexperiments(士SD)表3.2各腫瘤細(xì)胞株ING4和p一actin拷貝數(shù)名稱A549LTEP一a一2SW480GC一MSCPC3HELAUVEC一304hBM58416.9*1049.4*1033*1020.2*1013.8*1051.5*103215*1062.4*10一‘31.7*1046.1189*IOb2.61*10一4160*106233*10b98.9*1061.4*10一4310*1061.02*10一4288tin3.46*10一52.06*10一48.67*10一51.6*
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R346;R730.2

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 饒國(guó)洲;李昂;朱永進(jìn);石建峰;茍建重;張引成;;BIRC5 shRNA慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2011年07期

2 ;[J];;年期

3 ;[J];;年期

4 ;[J];;年期

5 ;[J];;年期

6 ;[J];;年期

7 ;[J];;年期

8 ;[J];;年期

9 ;[J];;年期

10 ;[J];;年期

相關(guān)會(huì)議論文 前1條

1 劉莉;采克俊;張易祥;李景芬;何湃;;MxA重組慢病毒的構(gòu)建及其體外感染雞精原干細(xì)胞[A];第二屆中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)暨細(xì)胞生物學(xué)教學(xué)改革會(huì)議論文集[C];2008年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前5條

1 全智華;人SR-PSOX/CXCL16基因轉(zhuǎn)染和沉默及其對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)功能的影響[D];南華大學(xué);2007年

2 陳小艷;LMP1~+/mCD99L2~-A20誘導(dǎo)小鼠A20細(xì)胞轉(zhuǎn)化為H/RS樣細(xì)胞的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2009年

3 李金東;RNAi沉默Med19基因?qū)θ朔伟〢549細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移影響的實(shí)驗(yàn)研究[D];吉林大學(xué);2009年

4 陸小明;RNAi抑制miR-221對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)影響及機(jī)制研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2012年

5 陳建軍;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞過(guò)表達(dá)MIR126移植通過(guò)AKT/ERK相關(guān)途徑促進(jìn)缺血心肌血管新生[D];中南大學(xué);2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

1 張蕾蕾;ING4基因在腫瘤發(fā)生中的檢測(cè)及其慢病毒載體的構(gòu)建[D];江蘇大學(xué);2008年

2 李躍艷;重組人結(jié)合磷脂酰絲氨酸和氧化脂蛋白的清道夫受體（SR-PSOX）的表達(dá)及其功能研究[D];南華大學(xué);2007年

3 王華;櫛孔扇貝（Chlamys farreri）心肌組織細(xì)胞培養(yǎng)的初步研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2009年

，

本文編號(hào)：2577645