【摘要】： 目的: 體外原核表達(dá)小鼠糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體家族相關(guān)配體(glucocorticoid-induced TNFR-related protein ligand,GITRL)蛋白,制備小鼠GITRL(mGITRL)多克隆抗體;體內(nèi)外研究mGITRL對(duì)小鼠Th17細(xì)胞產(chǎn)生的影響;建立小鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型,觀察mGITRL對(duì)CIA發(fā)病的影響,并尋找其作用機(jī)制。 方法: (1)取本室留存的mGITRL-pET-32a-E.coli BL-21菌種,涂板,挑取單個(gè)菌落接種于LB培養(yǎng)基中,1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)誘導(dǎo)蛋白表達(dá),SDS-PAGE電泳檢測(cè)mGITRL融合蛋白的表達(dá)情況。通過ProfinityIMAC Nickel柱分離純化目的蛋白,純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定,并通過內(nèi)毒素去除試劑盒去除蛋白中的內(nèi)毒素。將純化蛋白與弗氏佐劑乳化后免疫家兔,三次免疫后收集兔血清,ELISA法檢測(cè)兔抗小鼠GITRL抗體效價(jià),Western blot檢測(cè)抗體特異性。 (2)免疫磁珠法分離正常小鼠脾臟來源的CD4~+T細(xì)胞。將mGITRL蛋白及對(duì)照蛋白分別加入小鼠CD4~+T細(xì)胞的培養(yǎng)體系,在Th17細(xì)胞誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)96h,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17細(xì)胞的比例變化;收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,ELISA法檢測(cè)上清中細(xì)胞因子IL-17表達(dá)變化。 (3)正常小鼠體內(nèi)分別注射mGITRL蛋白及對(duì)照蛋白,10天后處死小鼠,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾臟中Th17細(xì)胞的比例變化及其轉(zhuǎn)錄因子RORγt的表達(dá)情況;ELISA法檢測(cè)小鼠血清中IL-17表達(dá)水平。 (4)建立小鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)模型。尾靜脈分別注射mGITRL蛋白及對(duì)照蛋白,觀察小鼠發(fā)病進(jìn)程(臨床評(píng)分,CIA發(fā)病率,病理學(xué)檢查);利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾臟及引流淋巴結(jié)中Th17細(xì)胞的比例、數(shù)目變化及其轉(zhuǎn)錄因子RORγt的表達(dá)情況;ELISA法檢測(cè)小鼠血清中IL-17表達(dá)水平。 結(jié)果: (1)攜帶表達(dá)載體mGITRL-pET-32a的E.coli BL-21細(xì)菌,經(jīng)終濃度為1mmol/L IPTG、30℃誘導(dǎo)6h,其融合蛋白分子量大小約為40KD,純化后目的蛋白純度＞90%;ELISA法檢測(cè)兔抗小鼠GITRL抗體效價(jià)為1:20000;Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示該抗體能與mGITRL蛋白特異性結(jié)合。 (2)免疫磁珠法分離獲得小鼠CD4~+T細(xì)胞,純度＞95%。在Th17細(xì)胞培養(yǎng)體系中,與對(duì)照蛋白相比,mGITRL使CD4~+IL-17~+(Th17)細(xì)胞的比例由14.1%上升到16.1%;且隨著mGITRL蛋白濃度增加(0.5、1、5、10μg/ml),Th17細(xì)胞的比例由15.81%上升為17.90%,細(xì)胞培養(yǎng)上清中分泌的細(xì)胞因子IL-17由387.51 pg/ml增加到512.70pg/ml。 (3)在正常小鼠體內(nèi),與注射對(duì)照蛋白(CTL組)的小鼠比較,注射mGITRL蛋白(GITRL組)的小鼠脾臟中Th17細(xì)胞比例增加極顯著(0.86±0.40%vs 1.77±0.49%,p＜0.01);CD4~+RORγt~+T細(xì)胞比例顯著性增加(1.21±0.55%vs 1.91±0.60%,p＜0.05);小鼠血清中IL-17含量增高(3.68±1.37 pg/ml vs 6.54±1.32 pg/ml,p＜0.05)。 (4)成功建立小鼠CIA模型。在模型鼠中,對(duì)照蛋白(CTL-CIA)組小鼠在第一次免疫后第32天發(fā)病,第46天病情達(dá)到高峰,臨床評(píng)分達(dá)9.1分;目的蛋白(GITRL-CIA)組小鼠,第一次免疫后第28天發(fā)病,第38天病情達(dá)到高峰,臨床評(píng)分達(dá)10.1分。病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn),CIA組小鼠及CTL-CIA組小鼠關(guān)節(jié)中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),滑膜增生明顯,未見軟骨損傷;GITRL-CIA組小鼠關(guān)節(jié)中除大量浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞和增生的滑膜外,可見明顯血管翳形成和軟骨損傷。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與CIA組小鼠(2.49×10~5±9.07×10~4)和CTL-CIA組小鼠(2.07×10~5±7.01×10~4)相比,GITRL-CIA組小鼠引流淋巴結(jié)中Th17細(xì)胞數(shù)目顯著性增加(2.30×10~6±9.11×10~5),結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);同時(shí)與CIA組小鼠(8.93±3.20 pg/ml)和CTL-CIA組小鼠(8.15±2.56 pg/ml)相比,GITRL-CIA組小鼠血清中IL-17A的含量顯著性升高(17.59±3.46 pg/ml),結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。 結(jié)論: (1)成功表達(dá)、純化小鼠GITRL蛋白,并制備其多克隆抗體。 (2)在體外,mGITRL蛋白可促進(jìn)小鼠Th17細(xì)胞的產(chǎn)生,且具有一定濃度依賴性。 (3)在體內(nèi),mGITRL蛋白可增加正常小鼠脾臟中Th17細(xì)胞的比例,上調(diào)RORγt的表達(dá);并促進(jìn)小鼠血清中IL-17含量增加。 (4)mGITRL蛋白可以加速并加重小鼠CIA的發(fā)病過程,并且這種作用可能與體內(nèi)Th17細(xì)胞的數(shù)目增加、血清中IL-17含量增高有關(guān)。
【圖文】：

2.1mGITRL融合蛋白的表達(dá)、純化及鑒ion，PurifieationandidentifieationofmProteinafterinduction;laneZ:thebaeteriumblank，nothing;lane4:thePurifiedreeombinaRL多克隆抗體效價(jià)和特異性的測(cè)定為陰性對(duì)照，ELISA法測(cè)定兔抗小鼠2.1為判斷指標(biāo)，結(jié)果顯示抗體滴度達(dá)顯示，兔抗血清可特異性結(jié)合小鼠好的蛋白是研究蛋白功能以及制備抗ProfinityIMAcNickel柱進(jìn)行蛋白純與融合蛋白上帶有的多聚組氨酸結(jié)合，

4.3.2mGITRL可以加重小鼠CIA發(fā)病程度在第一次免疫后第34天，取各組CIA小鼠受累關(guān)節(jié)，做病理切片HE染色。在顯微鏡下，我們可以觀察到(圖4.4):CIA組小鼠和CTL一CIA組小鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜細(xì)胞增生明顯，并呈粗大絨毛深入關(guān)節(jié)腔內(nèi)，增生滑膜中可偶見血管，但關(guān)節(jié)軟骨平滑，尚未發(fā)生損傷;GITRL一CIA組小鼠關(guān)節(jié)病變明顯，關(guān)節(jié)腔內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜細(xì)胞明顯增生，并伴有血管豁形成(圖片沒有顯示)，偶見軟骨和骨損傷(圖 4.4C，F(xiàn))。病理學(xué)評(píng)分見圖4.5，圖中水平線代表病理評(píng)分平均值，我們可以看到GrrRL一CIA組的平均值高于CIA組以及CTL一CIA組
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R392.11

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 汪麗云;GITR信號(hào)在ConA誘導(dǎo)的小鼠急性自身免疫性肝損害中的作用[D];華中科技大學(xué);2011年

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本文編號(hào)：2577979