【摘要】： 研究目的: 探討T-bet基因在DBA/1小鼠膠原誘導性關節(jié)炎(CIA)發(fā)生發(fā)展過程中的作用,及其作為類風濕性關節(jié)炎治療靶點的可能性。 研究方法: (1)根據(jù)國內外文獻,應用雞Ⅱ型膠原誘導DBA/1小鼠,建立膠原誘導的關節(jié)炎模型。 (2)構建小鼠T-bet基因特異性的shRNA真核干擾載體和針對無意義序列的對照質粒;通過將干擾質粒轉染DC2.4細胞,分析其功能。 (3)以表達T-bet基因的真核質粒及T-bet特異性真核干擾質粒進行關節(jié)局部干預,觀察各組小鼠關節(jié)炎發(fā)病時間及成模小鼠的行為改變,并收集各組小鼠關節(jié)、脾臟和腹股溝淋巴結。 (4)對病變關節(jié)行HE染色及免疫組化染色,觀察關節(jié)局部滑膜炎癥損傷程度及T-bet表達情況。 (5)應用熒光定量PCR法,檢測病變關節(jié)滑膜、脾臟及淋巴結T-bet和相關炎癥因子的表達水平。 研究結果: (1)成功建立了雞Ⅱ型膠原誘導的小鼠關節(jié)炎模型,小鼠關節(jié)炎的發(fā)病率為100%,平均發(fā)病時間為35±5天,關節(jié)炎癥得分為10±2分。 (2)成功構建了針對轉錄因子T-bet的特異性真核干擾質粒及針對無意義序列的對照質粒。通過對轉染有T-bet真核干擾質粒的DC2.4細胞研究表明,與對照組相比,T-bet mRNA及蛋白的表達水平均明顯降低,同時DC2.4細胞表達IFN-γ水平亦明顯降低。經(jīng)流式細胞儀分析顯示,轉有真核干擾質粒的DC2.4細胞,其表面CD80、CD86和MHCⅡ類分子均呈現(xiàn)明顯下調。提示,本試驗構建的針對T-bet基因的真核干擾質粒,能夠有效地抑制T-bet基因的表達,同時相關細胞因子和表面分子的表達水平也發(fā)生了相應的改變。 (3)膠原誘導性小鼠關節(jié)炎模型鼠的關節(jié)局部干預研究表明,在T-bet質粒干預小鼠,其關節(jié)局部可因T-bet基因的高表達而明顯促進關節(jié)炎的發(fā)生,發(fā)病率為100%,且發(fā)病時間提前,一般在誘模的第22天左右發(fā)病,平均發(fā)病時間為23±2天,關節(jié)平均炎癥評分3.5±0.5分;在T-bet干擾質粒干預的小鼠,其關節(jié)發(fā)病率僅為20%,平均發(fā)病時間延長為40±5天,炎癥評分1±0.5分。 結論: T-bet是Th1細胞特異性的轉錄因子,在初始T細胞向Th1細胞的分化過程中發(fā)揮了極其重要的作用。本試驗構建了T-bet特異性真核干擾質粒;經(jīng)轉染樹突狀細胞系表明,其對T-bet及其相關細胞因子的表達具有明顯的抑制作用;膠原誘導性關節(jié)炎小鼠模型局部應用的干預研究顯示,T-bet質粒關節(jié)局部注射后能夠明顯促進關節(jié)炎癥的發(fā)生,而注射T-bet干擾質粒則使發(fā)病率降低、發(fā)病時間延遲、炎癥程度減輕。提示,T-bet在類風濕性關節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展中起著關鍵性的作用,干擾T-bet的表達有助于對疾病的控制,也許不失為臨床類風濕性關節(jié)炎防治的新途徑。
【圖文】：

圖23CIA小鼠發(fā)病關節(jié)HE染色圖片F(xiàn)ig2.3H&EhistologicalanalysisofankleseetionsfrommieeofCIA注:A:CIA，J、鼠的發(fā)病關節(jié)(100x):B，C，D分別為放大為400x時的不同視野2.2.3CIA‘J、鼠脾臟和關節(jié)局部T一bet、I剛詳和IL一17的表達水平CIA小鼠脾臟細胞和關節(jié)局部組織的T-bet、IFN一Y和IL一17的mRNA水平，均比健康對照小鼠顯著增高，統(tǒng)計學處理呈現(xiàn)顯著性差異，P值均分別<0.05。見圖2.4。

3.2.1酶切結果雙酶切后質粒于309/L的瓊脂糖進行電泳，連接有T~bet特異性的ShRNA和無關序列對照經(jīng)過B哪兒萬I和 Hindm雙酶切后，可見65bp的小片段，，見圖3.1。1咬只、二L喊夕65bP圖3.1重組ShRNA載體酶切鑒定電泳圖 Fig3.lIdentifieationofT一bet一shRNAreeonstructedplasmid M:20bPDNAmarker; 2:doubledigestionofp一下 shRNAbyBa川Hl和 Hind111:3:double digestionofp一nonsense一 shRNAbyBaoHI和 Hind111;4:pGenesil一 1vector3.2.2測序結果重組質粒經(jīng)上海英駿公司測序，與設計序列完全相符，所含目的基因序列比對準確無誤，重組質粒構建成功，序列如下:
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R392.11

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本文編號：2575463