【摘要】： DNA疫苗作為一種新型疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比有著明顯的優(yōu)勢(shì),同時(shí)能誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫,而且抗原編碼的“裸”DNA具有相對(duì)安全、穩(wěn)定、生產(chǎn)方便和在體內(nèi)能介導(dǎo)抗原的長(zhǎng)期表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)。但是由于免疫原性相對(duì)較弱,目前DNA疫苗的發(fā)展仍然受到很大的限制。 提高抗原基因的表達(dá)對(duì)提高DNA疫苗的免疫原性起到重要的作用,抗原基因的優(yōu)化策略包括:對(duì)質(zhì)粒載體骨架調(diào)控元件的優(yōu)化和利用宿主基因的偏好對(duì)密碼子進(jìn)行優(yōu)化等。目前常利用人巨細(xì)胞病毒(hCMV)第一內(nèi)含子(IntronA)作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件,與hCMV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子(Promoter/Enhancer)一同提高缺失內(nèi)含子的目的基因的表達(dá)。有文獻(xiàn)報(bào)道,乙肝病毒(HBV)/旱獺肝炎病毒(WHV)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件(H/WPRE)、Mason-Pfizer猴病毒(MPMV)組成性轉(zhuǎn)運(yùn)元件(CTE)、單純皰疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)pre-mRNA加工增強(qiáng)元件(PPE)都能通過提高mRNA的穩(wěn)定性、3'末端的加工、促進(jìn)mRNA出細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中mRNA的積累來增強(qiáng)未經(jīng)剪接的基因表達(dá)。但是這類轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件是否能替代hCMVintronA或與其產(chǎn)生協(xié)同作用,從而提高DNA疫苗免疫原性還有待進(jìn)行研究。本研究首先通過刪除pVR1012質(zhì)粒載體hCMVIE imronA,構(gòu)建內(nèi)含子缺失的質(zhì)粒載體pCMV,然后將HPRE、WPRE、CTE、PPE元件分別克隆入pVR1012和pCMV,獲得了pIn-HPRE、pIn-WPRE、pIn-CTE、pIn-PPE和pHPRE、pWPRE、pCTE、pPPE載體。為比較hCMV IE intronA與HPRE、WPRE、CTE、PPE元件對(duì)目的基因表達(dá)的調(diào)控,將luciferase報(bào)告基因分別克隆入上述載體,體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與pVR1012載體相比pIn-HPRE和pIn-WPRE能顯著增強(qiáng)體外luciferase基因的表達(dá),而pHPRE、pWPRE與pVR1012無(wú)差別。為比較HPRE、WPRE元件在hCMV IE intronA存在和缺失的情況下,對(duì)體外抗原基因表達(dá)及體內(nèi)抗原特異的免疫反應(yīng)增強(qiáng)效果的差異,將野生型或密碼子優(yōu)化型的HIV-1 B'/C重組亞型CN54株Gag基因克隆入攜帶HPRE、WPRE元件的pVR1012和pCMV的載體,體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞和免疫Balb/C小鼠進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PRE元件能夠顯著地提高野生型Gag基因在293T細(xì)胞中的表達(dá),其中當(dāng)hCMV IE intronA和HPRE元件在載體上同時(shí)出現(xiàn)的時(shí)候基因的表達(dá)水平最高,而且pInHGagw(+intronA/+HPRE)在10μg劑量誘導(dǎo)出的免疫反應(yīng)水平高于pGagw(-intronA/-HPRE)以及pInGagw(+intronA/-HPRE)在40μg劑量所誘導(dǎo)的水平。雖然載體優(yōu)化對(duì)提高體外和體內(nèi)密碼子優(yōu)化型抗原基因表達(dá)作用不太明顯,但研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),如果載體經(jīng)hCMVIE intronA和HPRE元件的優(yōu)化,那么即使攜帶野生型基因的載體也能達(dá)到與等量的密碼子優(yōu)化Gag DNA疫苗體外抗原基因表達(dá)和體內(nèi)免疫原性相同的水平。 大量的實(shí)驗(yàn)證明佐劑能夠增強(qiáng)DNA疫苗的免疫原性�？ń榫募�(xì)胞壁骨架由分支菌酸、阿拉伯半乳糖、肽聚糖組成,能激活至少五種Toll樣受體(TLR1、TLR2、TLR4、TLR6和TLR9),同時(shí)BCG中富含有免疫調(diào)節(jié)作用的CpG基序,因此它被認(rèn)為是強(qiáng)有效的非特異免疫刺激劑,并在許多疫苗研究中得以使用�？ń槊缍嗵呛怂�(BCG-PSN)是經(jīng)熱酚法提取卡介菌多糖核酸制成的免疫調(diào)節(jié)劑,在臨床上已經(jīng)被成功地運(yùn)用于免疫失調(diào)或免疫水平下降及過敏性疾病的治療。本研究選擇卡介苗多糖核酸(BCG-PSN)作為佐劑,評(píng)價(jià)了在不同劑量、不同免疫次數(shù)下BCG-PSN對(duì)pDRVI1.0gp1455M(HIV-1 CN54 gp145基因)DNA疫苗誘導(dǎo)的體液免疫,細(xì)胞免疫以及長(zhǎng)期免疫記憶的增強(qiáng)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,BCG-PSN和DNA疫苗質(zhì)�；旌虾笞⑸�,能顯著地提高DNA疫苗的免疫原性。并且BCG-PSN的使用能夠減少DNA疫苗的免疫次數(shù),降低DNA疫苗的用量。 本研究為提高DNA疫苗免疫原性提供了新的途經(jīng),為開發(fā)中國(guó)株HIV-1 DNA疫苗奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【圖文】：

成:95℃變性4分鐘;95oC變性30see，60oC退火30se。，72oC延伸1而n，共30個(gè)循環(huán);72℃延伸8而n。1.2轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件的合成與基因的擴(kuò)增，，如圖1.1。pri二r(F)~弓卜.~一勁卜一一一一一日卜叫卜翩一—-嘲卜賺，叫沁翩prioer(R)圖1Figl基因合成方法示意圖 SehematiemaPofgenesynthesismethod首先通過基因合成的方式獲得HPRE，WP既，CTE和PPE元件，其中HPRE、WpRE、CTE元件用Xbal、坳八I克隆入載體MCS3’端，BGHPoly(A)序列上游，而PPE元件用筋aI、BamHI克隆入上述位置。

ag.Fg.R5’一CgCg兀州以幾絲幾終CA段媽CCAgCATCC5’一gCA段婦眾雙萬(wàn)CACTggCTgCT因葵沼TCgT-3’生型G銘基因擴(kuò)增的反應(yīng)條件:無(wú)菌dd踐036川，toXPcRBu.smMdNTp4林l，引物GagW，F(xiàn)、GagW.R(50林M)各l林l，質(zhì)粒解50呵川)2川，巧robest呷DNAPoly~1川，混勻后按下列條5oC變性3min:95℃變性30sec，60，C退火30溉，72，C延伸9072oC延伸smino碼子優(yōu)化型G雌基因擴(kuò)增反應(yīng)條件同上。體構(gòu)建及鑒定州，載體的構(gòu)建及鑒定PCR擴(kuò)增出的CMVPromoter.ExonA序列切膠回收，EcQRI和雙酶切的DNA質(zhì)粒載體pVRlolZ進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化Toplo感受l雙酶切篩選出陽(yáng)性克隆，重組質(zhì)粒命名為PCMV�？寺�(gòu)建方1.2]。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 高永鵬;BCR-ABL-SEA DNA疫苗誘導(dǎo)BALB/c小鼠特異性免疫應(yīng)答的研究[D];暨南大學(xué);2011年

本文編號(hào)：2575957