【摘要】： 非編碼RNA日益成為國際上研究的熱點(diǎn),它不僅能調(diào)控基因表達(dá),而且與癌癥密切相關(guān)。miRNA作為非編碼RNA一部分,組織特異性表達(dá)是其一個重要特征,發(fā)現(xiàn)組織特異性表達(dá)的miRNAs是研究其生物學(xué)功能的第一步。另外,miRNA在不同的發(fā)育階段以及不同的性別之間表達(dá)譜也不盡相同。本論文主要從以下三方面展開:(1)收集小鼠18種組織的miRNAs:利用EndNote,通過檢索PubMed獲得關(guān)于研究小鼠miRNA的文獻(xiàn)約300篇,并精讀文獻(xiàn)收集小鼠各組織在不同發(fā)育時期和不同性別等各種條件下表達(dá)的miRNAs,為組織特異性表達(dá)miRNAs的篩選做準(zhǔn)備;(2)采用微流體芯片技術(shù)篩選小鼠6種組織的miRNAs:微流體芯片技術(shù)具有靈活性強(qiáng)、自動化程度高、適用范圍廣、樣品損耗少、無交叉污染和結(jié)果重現(xiàn)性好等特點(diǎn),該技術(shù)的應(yīng)用為高通量篩選基因表達(dá)提供了一種便捷、經(jīng)濟(jì)高效的方法。通過解剖獲取四只C57BL/6小鼠六種組織:大腦,小腦,肝臟,肺,睪丸和腎。對于每種組織,分別取來自四只小鼠的等量組織混合后提取總RNA,利用尿素變性PAGE凝膠回收small RNA(smRNA,10-50 nt),分別將5’和3’RNA adapter連接到smRNA的兩端,通過RT-PCR構(gòu)建smRNA庫(smRNA庫中包含miRNA),利用非變性PAGE凝膠將miRNA對應(yīng)的條帶回收,最后通過熒光引物PCR(signal primer PCR)的方法對miRNA庫進(jìn)行熒光標(biāo)記。利用微流體芯片對各組織表達(dá)的miRNA進(jìn)行檢測,該方法對痕量表達(dá)的miRNAs有很好的檢測效果。為提高檢測結(jié)果的精確度,取5次重復(fù)中至少有4次檢測到信號的為可信結(jié)果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)大腦中有246條miRNAs表達(dá),小腦中有291條miRNAs表達(dá),肝臟中有209條miRNAs表達(dá),肺中有230條miRNAs表達(dá),睪丸中有84條miRNAs表達(dá),腎中有40條miRNAs表達(dá)。(3)結(jié)合(1)和(2)分析小鼠6種組織的組織特異性表達(dá)的miRNAs:通過對六種組織檢測到的miRNAs進(jìn)行比較篩選,得到除睪丸之外其它五種組織的組織特異性表達(dá)的miRNAs。為進(jìn)一步得到更為可靠的結(jié)果,與基于大量文獻(xiàn)收集的小鼠各組織在不同條件下表達(dá)的miRNAs進(jìn)行再一次的比較篩選,結(jié)果發(fā)現(xiàn),六種組織之間比較得出的組織特異性表達(dá)的miRNAs,有一部分miRNAs在其他組織中仍有表達(dá)。說明,信息學(xué)與實(shí)驗(yàn)學(xué)相結(jié)合是有力的科研手段。 微流體芯片技術(shù)與生物信息學(xué)的有機(jī)結(jié)合,不僅可以避免大量不必要的重復(fù)實(shí)驗(yàn),節(jié)約成本,而且可以加快科研速度,提升科研水平。二者的有力結(jié)合也必將為生物學(xué)的發(fā)展帶來新的契機(jī)。
【圖文】：

圖1.1 miRNAs生源論及其參與基因表達(dá)調(diào)控的兩種機(jī)制Fig. 1.1 miRNAs biogenesis and two mechanisms involved in gene expressions基因經(jīng)常成簇聚集在染色體上，在核仁內(nèi)由RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄形成pri-miR錄本與mRNA相似，5’端有帽子結(jié)構(gòu)，3’端有poly（A）。pri-miRNAs經(jīng)D理，在核仁內(nèi)行成大小為70 bp的pre-miRNA，pre-miRNAs在RNA-GTP的rtin 5輸出到細(xì)胞質(zhì)。在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，pre-miRNA經(jīng)過Dicer酶處理產(chǎn)生:miRNA*雙鏈體，miRNA*與miRNA互補(bǔ)。隨后，解鏈酶將該雙鏈體解鏈序列，miRNA*被降解，成熟的miRNA則形成由miRNA誘導(dǎo)的沉默A-induced silence complex, miRISC）[11, 12]。miRISC或者通過與mRNA的3’結(jié)合阻止蛋白質(zhì)的合成（圖1.1上右），或者通過與mRNA的不完全互補(bǔ)結(jié)A（圖1.1下右）。因此，miRNA對其靶mRNA的兩種調(diào)控機(jī)制依賴于二者在大多數(shù)情況下（例如在動物中），復(fù)合物中的單鏈miRNA與靶mRNA的補(bǔ)配對，從而阻斷該基因的翻譯過程，而靶mRNA的3’ UTR通常包含不同

字化光照合成設(shè)備，可進(jìn)行皮升級的生物化學(xué)反應(yīng)過程。功能化的微流體芯片特別適合于應(yīng)用到微量樣品的檢測，且無交叉污染、重現(xiàn)性好等是其最大的優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)使得在皮升級的反應(yīng)室內(nèi)合成高質(zhì)量的DNA和RNA寡核苷酸成為可能。圖1.2為微流體芯片結(jié)構(gòu)特征模型圖。微流體PicoArray反應(yīng)器是由硅質(zhì)材料經(jīng)微電子裝配程序制作而成，，該反應(yīng)器包含三種拓?fù)涮卣鳎浩ど壍姆磻?yīng)室，微流通道以及輸入和輸出孔。微流體芯片上含有3698（128× 31）個單獨(dú)的反應(yīng)室，每個反應(yīng)室容積為270 pl，錐形微流通道使得流入每個反應(yīng)室的樣品的流速均一，從而產(chǎn)生高密度均一的點(diǎn)。利用數(shù)字化光學(xué)裝置對反應(yīng)表面進(jìn)行光蝕刻發(fā)射，這一技術(shù)能夠在同一表面上大規(guī)模平行合成不同的分子，而不需要以前使用的昂貴而不便的微結(jié)構(gòu)光掩膜。與此同時，定制的序列也可以通過簡單的更改控制數(shù)字化光學(xué)裝置的程序而合成。圖 1.2 微流體反應(yīng)器主要結(jié)構(gòu)特征示意圖Fig. 1.2 Schematic illustration and the major features of the microfluidic reactor寡核苷酸探針通過預(yù)先設(shè)定好序列布局圖
【學(xué)位授予單位】：浙江理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R341

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2572369