【摘要】： 研究背景呼吸道合胞病毒(RSV)為副粘病毒科肺炎病毒屬、有包膜、非節(jié)段性的單負(fù)鏈RNA病毒。作為引起嬰幼兒下呼吸道感染最重要和常見的病毒病原體,RSV感染呼吸道上皮細(xì)胞后,誘導(dǎo)產(chǎn)生大量細(xì)胞因子、趨化因子、活性氧等活性介質(zhì),導(dǎo)致嬰幼兒喘息性疾病的發(fā)生。近年來發(fā)現(xiàn)Toll樣受體(TLR)在抗病原微生物免疫防御反應(yīng)中起重要作用,通過識(shí)別細(xì)菌、病毒和環(huán)境中相應(yīng)抗原的保守結(jié)構(gòu),啟動(dòng)天然免疫應(yīng)答,TLR在聯(lián)系天然免疫和獲得性免疫中起橋梁作用。以往研究大多集中在探討TLR在細(xì)菌感染中的作用,隨著研究的深入,TLR在病毒感染中的作用日益受到關(guān)注。其中,TLR4通過識(shí)別RSV融合蛋白(F)蛋白,在RSV感染的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。我們的研究結(jié)果證實(shí)RSV感染后氣道上皮細(xì)胞TLR4表達(dá)增加,增加了上皮細(xì)胞對隨后的環(huán)境刺激因素如脂多糖(LPS)的敏感性,明顯增強(qiáng)炎癥反應(yīng)。 RSV引起的呼吸道感染患兒氣道聚集大量中性粒細(xì)胞,在清除病原微生物的同時(shí)也導(dǎo)致了自身細(xì)胞的損傷和死亡。中性粒細(xì)胞表達(dá)除TLR3以外所有的TLRs。研究證實(shí)TLR4表達(dá)對中性粒細(xì)胞的聚集、黏附、凋亡、細(xì)胞因子或趨化因子以及活性氧產(chǎn)生起重要調(diào)控作用。 迄今為止尚沒有治療RSV感染的特效藥,采用糖皮質(zhì)激素尤其是地塞米松(Dexamethasone,DEX)治療RSV引起的喘息性疾病存在爭議。一方面,DEX可下調(diào)心、肺組織及單核細(xì)胞TLR4表達(dá),抑制NF-κB活性及TNF-α等炎癥因子產(chǎn)生,促進(jìn)中性粒細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗炎作用保護(hù)機(jī)體,另一方面, DEX改變Thl/Th2細(xì)胞偏移,促進(jìn)Th2發(fā)育,可能加重變態(tài)反應(yīng)性炎癥。目前尚未見DEX對RSV感染后中性粒細(xì)胞TLR4表達(dá)、炎癥因子分泌以及殺菌功能影響的相關(guān)研究報(bào)道。 本研究擬從RSV感染對中性粒細(xì)胞TLR4表達(dá)與功能影響,進(jìn)一步探討RSV感染免疫發(fā)病機(jī)理,體外觀察DEX對RSV感染后中性粒細(xì)胞TLR4表達(dá)及功能的影響,為尋找防治RSV感染后氣道炎癥產(chǎn)生的新方法提供理論依據(jù)。 第一部分RSV對中性粒細(xì)胞TLR4表達(dá)及功能影響 目的探討RSV感染后中性粒細(xì)胞TLR4表達(dá)及IL-6、IL-8和H2O2水平變化,進(jìn)一步明確TLR4信號(hào)通路在中性粒細(xì)胞功能發(fā)揮中的作用。 方法取健康體檢兒童全血,分離中性粒細(xì)胞,設(shè): RSV感染組、TLR4阻斷組及對照組。其中:RSV感染組加入RSV病毒懸液共同培養(yǎng),TLR4阻斷組預(yù)先加入TLR4阻斷劑HTA125培養(yǎng)0.5h后再加入RSV病毒懸液共同培養(yǎng),對照組用培養(yǎng)基或生理鹽水代替RSV懸液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用流式細(xì)胞儀檢測中性粒細(xì)胞表面TLR4表達(dá),及H2O2產(chǎn)生,培養(yǎng)18h后離心收集上清液,采用ELISA方法檢測中性粒細(xì)胞產(chǎn)生IL-6和IL-8水平。 結(jié)果(1) RSV感染后,TLR4陽性中性粒細(xì)胞為28.798±5.266%較對照組TLR4陽性中性粒細(xì)胞(17.476±5.853%)明顯增高;中性粒細(xì)胞IL-6和IL-8的表達(dá)均明顯增加,RSV感染組IL-6和IL-8分別為466.03±36.478 pg/ml和1528.96±72.55 pg/ml,明顯高于對照組(IL-6:21.205±15.059 pg/ml;IL-8:399.34±267.45pg/ml);RSV感染后中性粒細(xì)胞產(chǎn)生H2O2為105.223±9.633MFI,較對照組(H2O2:39.004±1.30MFI)明顯增加。(2)阻斷中性粒細(xì)胞TLR4信號(hào)傳導(dǎo),RSV感染誘導(dǎo)的IL-6產(chǎn)生減少(阻斷組IL-6:391.307±43.45pg/ml;RSV感染組IL-6:466.03±36.478 pg/ml),中性粒細(xì)胞產(chǎn)生H2O2增加(阻斷組H2O2:116.787±12.059 MFI;RSV感染組H2O2:105.223±9.633 MFI),IL-8產(chǎn)生沒有顯著影響。 結(jié)論RSV感染可上調(diào)中性粒細(xì)胞TLR4表達(dá),誘導(dǎo)IL-6、IL-8及H2O2產(chǎn)生,TLR4信號(hào)通路影響RSV感染后中性粒細(xì)胞IL-6和H2O2產(chǎn)生。 第二部分地塞米松對RSV感染中性粒細(xì)胞TLR4表達(dá)及功能影響 目的地塞米松(DEX)治療RSV感染引起的喘息性疾病的有效性存在爭議。動(dòng)物模型證實(shí)DEX可通過影響中性粒細(xì)胞功能發(fā)揮抗炎作用,保護(hù)肺組織。本研究旨在探討DEX對RSV感染后中性粒細(xì)胞TLR4表達(dá),細(xì)胞因子IL-6、IL-8分泌以及H2O2產(chǎn)生的影響,并施以阻斷劑干預(yù),闡明DEX對中性粒細(xì)胞的作用與TLR4信號(hào)通路的關(guān)系,為DEX的應(yīng)用提供理論依據(jù)。 方法取健康體檢兒童全血,分離中性粒細(xì)胞,計(jì)數(shù),分成五組:RSV組、DEX組、RSV+DEX組、RSV+DEX+HTA125組及對照組。RSV組加入RSV病毒懸液共同培養(yǎng),DEX組只加入DEX, RSV+DEX組加入DEX和RSV病毒懸液共同培養(yǎng),RSV+DEX+HTA125組預(yù)先加入HTA125培養(yǎng)0.5h后再加入RSV病毒懸液和DEX共同培養(yǎng),對照組用培養(yǎng)基或生理鹽水代替RSV懸液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。同時(shí),以布地奈德(BUD)作為不同激素對照進(jìn)行上述試驗(yàn)。1h后流式細(xì)胞儀檢測中性粒細(xì)胞TLR4表達(dá),2h后流式細(xì)胞儀檢測中性粒細(xì)胞H2O2產(chǎn)生,18h后離心收上清液ELISA試劑盒檢測中性粒細(xì)胞分泌的IL-6、IL-8。 結(jié)果(1) DEX下調(diào)RSV感染后中性粒細(xì)胞TLR4表達(dá):RSV+DEX組TLR4陽性中性粒細(xì)胞為23.572±4.191%較RSV組TLR4陽性中性粒細(xì)胞(28.798±5.266%)明顯降低;(2) DEX顯著減少RSV感染的中性粒細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、IL-8和H2O2:RSV+DEX組IL-6、IL-8和H2O2分別為377.86±12.51pg/ml、724.976±56.82pg/ml和89.22±11.32 MFI,明顯低于RSV組(IL-6:557.60±3.34 pg/ml;IL-8:1089.558±28.57 pg/ml;H2O2:105.22±9.63MFI)。BUD下調(diào)RSV感染后中性粒細(xì)胞TLR4表達(dá),減少IL-6產(chǎn)生,但對IL-8和H2O2沒有影響。(3)阻斷TLR4,DEX對RSV感染中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-6的抑制作用進(jìn)一步增強(qiáng),逆轉(zhuǎn)DEX對RSV感染中性粒細(xì)胞H2O2產(chǎn)生的抑制作用:RSV+DEX+HTA125組IL-6 (238.42±15.37pg/ml)較RSV+DEX組IL-6 (252.016±10.116pg/ml)減低; RSV+DEX+HTA125組H2O2 (101.575±13.9MFI)較RSV+DEX組H2O2 (89.219±11.32MFI)增加。阻斷中性粒細(xì)胞TLR4對BUD作用沒有影響。 結(jié)論DEX下調(diào)RSV感染后中性粒細(xì)胞TLR4表達(dá),抑制中性粒細(xì)胞的功能,減輕炎癥反應(yīng),阻斷TLR4可協(xié)同DEX發(fā)揮抗炎作用,逆轉(zhuǎn)DEX抑制中性粒細(xì)胞吞噬殺傷作用。
【圖文】：

36圖1-6 阻斷中性粒細(xì)胞TLR4后RSV感染H2O2產(chǎn)生 (A為對照組，B為RSV組，C為阻斷組)Fig.1-6 The production of neutrophil H2O2stimulated by RSV pre- and post- TLR4 blocked（

37圖2-2 DEX和BUD對RSV感染中性粒細(xì)胞TLR4表達(dá)的影響（A為對照組，B為RSV組，，C為DEX+RSV組，D為BUD+RSV組）Fig.2-2 The effect of DEX or BUD on TLR4 expression on neutrophil infected by RSV( A was control; B was RSV group; C was DEX and RSV group; D was BUD and RSV group)
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R392.33

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本文編號(hào)：2571285