發(fā)布時(shí)間：2020-01-20 15:30

【摘要】：目的通過構(gòu)建嵌合丙型肝炎病毒(HCV)1a與1b亞型包膜蛋白基因的質(zhì)粒,建立嵌合型HCV的體外細(xì)胞培養(yǎng)模型,為針對(duì)中國HCV主要基因型的抗病毒藥物篩選和HCV抗原免疫效果評(píng)價(jià)提供有效模型。方法1.運(yùn)用融合PCR技術(shù),通過酶切、重組等手段將中國HCV HeBei分離株(1b)和H77株(1a)的全長包膜蛋白基因(E1/E2)引入JFH1株(2a)基因骨架,構(gòu)建包膜蛋白基因區(qū)相互置換的嵌合病毒(1b/2a和1a/2a)全長基因組質(zhì)粒;2.HCV(1b/2a)和HCV(1a/2a)全長基因組質(zhì)粒經(jīng)Xbal單酶切線性化后體外轉(zhuǎn)錄獲得全長病毒RNA,將RNA轉(zhuǎn)染Huh7.5.1細(xì)胞,進(jìn)行間接免疫熒光、蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測。結(jié)果1.成功構(gòu)建了含嵌合病毒1b/2a、1a/2a全長基因組的重組質(zhì)粒pHe-Bei(E1E2)/JFH1和pH77(E1E2)/JFH1;2.分別以pHeBei(E1E2)/JFH1和pH77 (E1E2)/JFH1為模板,體外轉(zhuǎn)錄獲得病毒RNA,將RNA轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞Huh7.5.1細(xì)胞,間接免疫熒光法檢測72h后轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞率為1%～3%,5d后陽性細(xì)胞率為20%～50%; Western blot檢測到細(xì)胞內(nèi)HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS3和結(jié)構(gòu)蛋白Core的表達(dá)。結(jié)論本研究首次在國內(nèi)建立了嵌合中國HCV分離株(HeBei株)基因的HCV細(xì)胞培養(yǎng)模型,病毒RNA可在培養(yǎng)細(xì)胞中復(fù)制和表達(dá),產(chǎn)生嵌合HCV,嵌合型HCV可以在細(xì)胞間傳播。
【圖文】：

2.3三片段融合PCR以A一S和D一A為引物，分別以回收的Fl、FZ、F3和Fl、F4、FS三個(gè)片段混合物為模板，進(jìn)行PcR擴(kuò)增，得到2900bP的融合基因片段F6和F7，，片段大小與預(yù)期相符(圖3)。 H77HeBe1H77HeBei\一//一一﨏﨏

本文編號(hào)：2571307