【摘要】： 佐劑在疫苗的使用及發(fā)展中擔(dān)負(fù)著重要作用。很多傳統(tǒng)疫苗如果沒有佐劑作用,其免疫效果受到極大影響,特別是對一些新型疫苗(如DNA疫苗)的研發(fā)或改進,有效佐劑是一個重要的突破點。迄今,人類研究的佐劑種類繁多,但人用佐劑仍以鋁佐劑為主。雖然Novartis公司已經(jīng)將MF59作為佐劑用于復(fù)立達(dá)(流感病毒亞單位佐劑疫苗)在歐洲各國獲批準(zhǔn),但是美國食品藥品管理局(FDA)至今未予批準(zhǔn),我國國家食品藥品監(jiān)督管理局也是07年才批準(zhǔn)其在中國上市的。GSK公司的宮頸癌疫苗Cervarix采用的AS04佐劑也屬于人用佐劑,已獲歐盟專利,但在我國尚未批準(zhǔn)上市。目前研究的眾多佐劑中,盡管有些佐劑具有較強的免疫刺激活性,但因毒副作用大而限制其臨床研究。 本課題主要研究了兩種生物佐劑:BCG-CpG-DNA(簡稱CpG)和Vaccae(微卡,即母牛分支桿菌菌苗,簡稱Va)。BCG-CpG-DNA是本實驗室從BCG中提取的天然CpG DNA,它除了具有一般CpG的良好免疫刺激活性,還因為BCG作為疫苗在世界范圍內(nèi)沿用多年,證明其具有良好的安全性,而安全性正是限制目前大部分在研佐劑進入臨床研究的瓶頸。Vaccae作為雙向免疫調(diào)節(jié)劑,有較好的免疫刺激效果,目前已有較多將Vaccae聯(lián)合乙肝疫苗治療慢性乙型肝炎的實驗研究。本研究通過體外細(xì)胞水平實驗和小鼠體內(nèi)刺激實驗,初步探討上述兩種佐劑的免疫刺激活性,并將兩種佐劑分別聯(lián)合不含氫氧化鋁佐劑的重組乙肝疫苗(HBsAg)和含氫氧化鋁佐劑的重組乙肝疫苗(Al(OH)3-HBsAg),觀察單獨生物佐劑及聯(lián)合佐劑(CpG / Va +Al(OH)3)對乙肝疫苗免疫后免疫反應(yīng)的影響并初步探討其作用機制。 利用體外細(xì)胞水平刺激實驗和小鼠體內(nèi)刺激實驗,探討CpG和Va的免疫刺激活性。主要實驗方法包括:1)佐劑對吞噬細(xì)胞吞噬功能的影響:采用碳粒廓清實驗,比較經(jīng)CpG / Va免疫的小鼠與未經(jīng)佐劑免疫的對照組小鼠的吞噬細(xì)胞吞噬功能是否存在差異;2)佐劑體外刺激試驗:用CpG / Va單獨或聯(lián)合ConA體外刺激BALB/c小鼠的脾淋巴細(xì)胞,ELISA法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-?和IL-10分泌水平,判斷佐劑體外是否具有刺激Th1/Th2類細(xì)胞免疫的活性;3)佐劑小鼠體內(nèi)刺激試驗:經(jīng)CpG / Va免疫C57BL/6小鼠,每7天免疫1次,共免疫3次,末次免疫后7天取脾淋巴細(xì)胞,用ELISPOT法測定IFN-?和IL-10的分泌水平,用MTT法測定體外培養(yǎng)68小時后的脾淋巴細(xì)胞的增殖能力,分析CpG / Va的細(xì)胞免疫刺激活性。 我們將CpG / Va作為佐劑聯(lián)合重組HBsAg和重組乙肝疫苗(含氫氧化鋁佐劑的重組HBsAg)免疫小鼠,具體分組為:N.S.組、Ag組、Va+Ag組、CpG+Ag組、Al+Ag組、Va+Al+Ag組和CpG+Al+Ag組。通過以下實驗觀察佐劑對乙肝疫苗免疫反應(yīng)的影響、并初步探討佐劑的作用機制。主要實驗方法包括:1)病理學(xué)研究:于免疫后不同時間采集經(jīng)各組小鼠的注射部位肌肉、脾臟和淋巴結(jié),制作組織切片,進行HE染色,觀察佐劑對組織的病理學(xué)影響;2)佐劑的抗原遞送及緩釋作用研究:通過ELISA法測定組織勻漿和血清中HBsAg,比較不同免疫組小鼠組織內(nèi)的HBsAg含量-時間變化趨勢,分析佐劑是否存在抗原遞送(antigen delivery)及抗原緩釋作用;3)佐劑對疫苗細(xì)胞免疫應(yīng)答影響:ELISPOT法測定含不同佐劑疫苗免疫小鼠后Th1型免疫應(yīng)答的變化;4)佐劑對疫苗體液免疫應(yīng)答影響:于免疫后不同時間,采用ELISA法測定小鼠體液免疫應(yīng)答水平,判斷不同佐劑對于抗原特異性抗體出現(xiàn)的時間以及量的影響。 佐劑的免疫刺激活性研究結(jié)果顯示:1)CpG和Va對小鼠吞噬細(xì)胞的吞噬功能影響不明顯;2)CpG在體內(nèi)、體外均能夠誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IFN-?,并能夠增強ConA刺激脾淋巴細(xì)胞分泌IFN-?的能力;CpG在體內(nèi)、體外不能明顯刺激脾淋巴細(xì)胞分泌IL-10。Va在體內(nèi)、體外誘導(dǎo)IFN-?分泌的能力不明顯,但能誘導(dǎo)分泌高水平的IL-10,并能增強ConA刺激脾淋巴細(xì)胞分泌IFN--?的能力,抑制ConA刺激脾淋巴細(xì)胞分泌IL-10的能力。3)CpG和Va均能刺激小鼠淋巴細(xì)胞的增殖。由上述結(jié)果可以初步判斷CpG具有誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞免疫刺激的活性,而Va則能夠誘導(dǎo)Th1型和Th2型細(xì)胞免疫應(yīng)答。 佐劑聯(lián)合重組乙肝疫苗研究結(jié)果顯示:1)CpG和Va有增加注射部位肌肉炎細(xì)胞浸潤的趨勢;2)CpG和Va本身具有輕微的抗原緩釋作用,在免疫后1天時,注射部位肌肉中抗原含量比不含佐劑的HBsAg組高2~4倍,但比Al(OH)3的緩釋作用弱;而CpG / Va與Al(OH)3存在協(xié)同緩釋作用,聯(lián)合佐劑組在免疫后4~10天左右注射部位肌肉中抗原含量較單獨Al(OH)3佐劑組高;3)CpG和Va佐劑的應(yīng)用利于大量HBsAg進入脾臟,CpG / Va聯(lián)合Al(OH)3較單獨CpG / Va佐劑抗原遞送作用增強;4)含CpG佐劑的重組乙肝疫苗在免疫后7天能有效誘導(dǎo)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分泌Th1細(xì)胞因子(IFN-?和IL-2);含Va佐劑的重組乙肝疫苗在免疫后7天誘導(dǎo)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分泌IFN-?、IL-2水平較低,Va+Al佐劑對IFN-?、IL-2的誘導(dǎo)能力大于單獨Va佐劑組(也大于單獨Al佐劑組),加強免疫1針后的陽轉(zhuǎn)比例有所升高;并且Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答水平與HBsAg劑量有關(guān),抗原免疫劑量為3μg的組別在免疫后7天陽轉(zhuǎn)比例大于抗原免疫劑量為1μg的組別;5)CpG和Va均能提高HBsAg免疫后血清抗體滴度。CpG和Va與Al(OH)3之間均存在協(xié)同作用,與單獨使用HBsAg相比,能夠提早血清抗體的產(chǎn)生,并使抗體滴度提高。 綜上所述,這兩種佐劑均具有一定程度的細(xì)胞免疫刺激活性。作為佐劑對于乙肝疫苗免疫后的抗原遞送和緩釋具有一定作用,并且能夠提高小鼠對重組乙肝疫苗的細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答水平,有望作為疫苗佐劑。
【圖文】：

圖 3. Va/CpG 體外刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞后 MTT 實驗結(jié)果2.712 2.6586.41513.79913.1664.8075.596.20102468101214161820CpGVaConACpG+ConAVa+ConALPSCpG+LPSVa+LPS刺激原IS圖 4. Va/CpG 體外刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖情況3.1 Va 和 CpG 體外能刺激脾淋巴細(xì)胞增殖CpG、Va、ConA 和 LPS 與不加刺激原的對照組（用完全培養(yǎng)基 1

Va/CpG體內(nèi)刺激C57BL/6小鼠MNCs分泌IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點形成細(xì)胞數(shù)(n=8)
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R392

【參考文獻】

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1 李海英;陶明玲;陳新月;汪俊韜;;聯(lián)合抗病毒治療慢性乙型肝炎臨床觀察[J];實用肝臟病雜志;2006年04期

2 白玉;楊煥;;新佐劑疫苗臨床研究的基本考慮[J];中國臨床藥理學(xué)雜志;2007年04期

3 饒高峰,吳高達(dá);微卡7人9次的副反應(yīng)報告[J];臨床肺科雜志;2005年01期

4 吳超,鄒全明;新型疫苗佐劑的研究進展[J];中國生物工程雜志;2005年08期

5 趙愛華;喬來艷;賈淑珍;寇麗杰;王國治;;BCG-CpG-DNA對重組HBsAg的免疫佐劑作用[J];中國生物制品學(xué)雜志;2007年05期

6 徐燦;李兆申;杜奕奇;屠振興;龔燕芳;許國銘;;以白細(xì)胞介素-2為免疫佐劑的幽門螺桿菌尿素酶B亞單位核酸疫苗的構(gòu)建及其免疫保護作用[J];胃腸病學(xué);2007年05期

7 趙愛華,賈淑珍,喬來艷,寇麗杰,王國治;BCG-CpG-DNA制備、理化特性及免疫刺激活性的初步研究[J];微生物學(xué)免疫學(xué)進展;2005年01期

8 李鳳祥;趙愛華;張潔;王國治;;BCG-CpG-DNA對重組HBsAg免疫原性的影響[J];微生物學(xué)免疫學(xué)進展;2008年03期

9 湯承;岳華;呂鳳林;景波;;納米鋁佐劑誘導(dǎo)雞提前產(chǎn)生抗AIVH9體液免疫應(yīng)答[J];西南民族大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2006年05期

10 劉勇;吳超;陳軍浩;陳廣梅;薛世貴;嚴(yán)曉敏;;CpG對HBV感染者B細(xì)胞及Th1型細(xì)胞因子的活化作用[J];世界華人消化雜志;2008年14期

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本文編號：2571099