【摘要】： 血管內(nèi)皮損傷是動(dòng)脈粥樣硬化、血管再狹窄等心血管疾病的始動(dòng)因素。其病理基礎(chǔ)是血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,內(nèi)膜下基質(zhì)暴露,血小板黏附聚集于該處,脫顆粒釋放出有絲分裂原,后者在趨化血小板和粒細(xì)胞聚集的同時(shí),又刺激中膜平滑肌細(xì)胞增殖、遷移、分泌以及血管壁結(jié)構(gòu)的重塑。同時(shí),血管內(nèi)皮完整性的破壞也會(huì)導(dǎo)致其自身分泌的血管保護(hù)性介質(zhì)(一氧化氮、前列環(huán)素等)的減少,血管收縮性介質(zhì)及促生長物質(zhì)的分泌增多。研究表明血管損傷后早期管腔內(nèi)的再上皮化速度是決定修復(fù)后局部內(nèi)膜增生程度的重要因素。如何加快損傷血管腔內(nèi)面的上皮化從而有效修復(fù)內(nèi)皮并抑制平滑肌增生已成為研究熱點(diǎn)之一 內(nèi)皮祖細(xì)胞是一類來源于骨髓,動(dòng)員后可進(jìn)入外周血循環(huán),定向歸巢至損傷部位并進(jìn)行分化的祖細(xì)胞群。大量研究已表明內(nèi)皮祖細(xì)胞在血管新生和內(nèi)膜修復(fù)中的重要作用。但在體外如何獲取足量的內(nèi)皮祖細(xì)胞,同時(shí)保證細(xì)胞的活性及生物學(xué)特征,避免其出現(xiàn)分化異常等仍是學(xué)者們需要解決的問題。另外了解內(nèi)皮祖細(xì)胞體內(nèi)的生物學(xué)分布、分化增殖等細(xì)胞的定位反饋情況可優(yōu)化移植細(xì)胞的途徑和細(xì)胞移植治療的時(shí)間,從而指導(dǎo)臨床的進(jìn)一步治療。 磁共振成像(MRI)具有特異性和敏感性高,空間分辨力強(qiáng)及臨床安全等優(yōu)勢得以迅速發(fā)展,同時(shí)磁性物質(zhì)標(biāo)記細(xì)胞后并不會(huì)對細(xì)胞產(chǎn)生顯著的生物學(xué)影響,且不需要放射性同位素(利于縱向長期研究),因而廣泛用于體內(nèi)示蹤干細(xì)胞的影像學(xué)檢查。本研究利用磁性物質(zhì)標(biāo)記細(xì)胞,從而體外示蹤移植細(xì)胞的生物學(xué)分布。首先我們體外分離培養(yǎng)出間充質(zhì)干細(xì)胞,并在一定的條件下誘導(dǎo)其分化成為內(nèi)皮祖細(xì)胞并擴(kuò)增,隨后通過超順磁性氧化鐵顆粒標(biāo)記細(xì)胞,并將標(biāo)記后的細(xì)胞移植入實(shí)驗(yàn)動(dòng)脈頸動(dòng)脈損傷模型,從而動(dòng)態(tài)示蹤細(xì)胞并評估內(nèi)皮祖細(xì)胞在內(nèi)皮修復(fù)過程中的作用。 第一部分 骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 目的：體外分離、培養(yǎng)、鑒定及擴(kuò)增兔骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化后的內(nèi)皮祖細(xì)胞。方法：密度梯度離心法結(jié)合貼壁法從骨髓中分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)。以VEGF、bFGF定向誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為內(nèi)皮祖細(xì)胞。對誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞、免疫熒光及免疫組織化學(xué)鑒定。結(jié)果：誘導(dǎo)后24h圓形細(xì)胞貼壁；72h細(xì)胞集落形成,呈紡錘形放射狀生長；5d細(xì)胞呈漩渦狀或條索狀生長；7d內(nèi)皮樣細(xì)胞成片生長,互相連接并具有管腔樣結(jié)構(gòu)。流式細(xì)胞儀檢測提示CD34、CD133雙陽細(xì)胞占2.16±0.09%；免疫組化提示KDR陽性細(xì)胞占72.56±8.76%。激光共聚焦顯微鏡觀察顯示細(xì)胞Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1呈雙染陽性。結(jié)論：密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離出的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,通過體外誘導(dǎo)分化可培養(yǎng)成為內(nèi)皮祖細(xì)胞。 第二部分 體外超順磁性氧化鐵納米顆粒及綠色熒光蛋白病毒顆粒標(biāo)記內(nèi)皮祖細(xì)胞的生物學(xué)研究 目的：評估超順磁性納米鐵顆粒及綠色熒光蛋白慢病毒顆粒標(biāo)記對內(nèi)皮祖細(xì)胞的毒性及細(xì)胞活力影響。方法：分別采用不同濃度的納米鐵顆粒轉(zhuǎn)染和不同感染復(fù)數(shù)的慢病毒顆粒感染內(nèi)皮祖細(xì)胞,評估細(xì)胞的MRI信號強(qiáng)度及細(xì)胞的活力試驗(yàn)、增殖試驗(yàn)、LDH釋放試驗(yàn)、遷移試驗(yàn)及對細(xì)胞周期和凋亡試驗(yàn)。結(jié)果：隨著納米鐵濃度的增加,T2WI MRI信號強(qiáng)度逐漸降低,在50ug/ml和100ug/ml難以分辨；細(xì)胞活力試驗(yàn)提示隨著鐵濃度的增加,細(xì)胞活力逐漸減低；LDH釋放率逐漸增加,但10%；對增殖能力、遷移能力及細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡均無影響。隨著感染復(fù)數(shù)(MOI)的增加,細(xì)胞活力明顯下降,MOI=50,細(xì)胞活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05), MOI=50, LDH釋放率為10.34%,對細(xì)胞有一定毒性；MOI=25和50,細(xì)胞凋亡增加差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),且遷移能力受到影響(P0.05)；不同MOI對增殖能力影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：Fe2+濃度在25ug/ml, MOI=10的條件下,超順磁性氧化鐵顆粒對內(nèi)皮祖細(xì)胞的生物學(xué)特性沒有影響,可以作為磁標(biāo)記。 第三部分 體內(nèi)磁共振成像示蹤超順磁性氧化鐵納米顆粒標(biāo)記的內(nèi)皮祖細(xì)胞修復(fù)內(nèi)膜損傷的實(shí)驗(yàn)研究 目的：評價(jià)MRI示蹤SPIO標(biāo)記的內(nèi)皮祖細(xì)胞移植促損傷動(dòng)脈內(nèi)皮修復(fù)的作用。方法：將菲立磁和綠色熒光蛋白雙標(biāo)記的內(nèi)皮祖細(xì)胞局部注入球囊損傷的頸動(dòng)脈段腔內(nèi),術(shù)后1d、7d和28d行磁共振掃描、組織學(xué)檢查及內(nèi)皮型一氧化氮合成酶檢測。結(jié)果：磁共振掃描發(fā)現(xiàn)移植部位出現(xiàn)低信號區(qū)。移植組HE、普魯士藍(lán)、vWF免疫組化染色、顯微熒光均提示內(nèi)皮祖細(xì)胞可粘附于內(nèi)膜損傷處,并隨時(shí)間分化為內(nèi)皮細(xì)胞；同時(shí)內(nèi)皮型一氧化氮合成酶表達(dá)隨時(shí)間變化而增多。結(jié)論：菲立磁標(biāo)記的內(nèi)皮祖細(xì)胞可促進(jìn)損傷動(dòng)脈內(nèi)皮的修復(fù),并可為MRI示蹤。
【圖文】：

個(gè)核細(xì)胞為主的白色云霧層狹窄帶。(見圖l一1)。收集的單個(gè)核細(xì)胞早期呈懸浮生長，小圓細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞接種24h后，開始出現(xiàn)少許貼壁細(xì)胞(圖1一2一A)，培養(yǎng)2~3d，可見細(xì)胞開始呈集落生長，單個(gè)生長的細(xì)胞呈短梭形或紡錘形，核分裂明顯(圖1一2一B)，隨培養(yǎng)時(shí)間延長，貼壁細(xì)胞明顯增多，集落逐漸增大，出現(xiàn)形態(tài)均一、呈放射狀排列的細(xì)胞集落。培養(yǎng)3~5d后細(xì)胞分裂增殖十分明顯，呈條索狀或漩渦狀生長(圖1一2一C)。懸浮細(xì)胞隨著換液次數(shù)的增多而逐漸被去除，約7~8d左右

個(gè)核細(xì)胞為主的白色云霧層狹窄帶。(見圖l一1)。收集的單個(gè)核細(xì)胞早期呈懸浮生長，小圓細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞接種24h后，開始出現(xiàn)少許貼壁細(xì)胞(圖1一2一A)，培養(yǎng)2~3d，可見細(xì)胞開始呈集落生長，單個(gè)生長的細(xì)胞呈短梭形或紡錘形，核分裂明顯(圖1一2一B)，隨培養(yǎng)時(shí)間延長，貼壁細(xì)胞明顯增多，集落逐漸增大，出現(xiàn)形態(tài)均一、呈放射狀排列的細(xì)胞集落。培養(yǎng)3~5d后細(xì)胞分裂增殖十分明顯，呈條索狀或漩渦狀生長(圖1一2一C)。懸浮細(xì)胞隨著換液次數(shù)的增多而逐漸被去除，約7~8d左右
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 李崇劍,高潤霖;血管內(nèi)皮祖細(xì)胞研究進(jìn)展[J];中國分子心臟病學(xué)雜志;2004年06期

2 麥筱莉;滕皋軍;馬占龍;孫軍輝;張宇;顧寧;;外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞磁探針標(biāo)記及體外磁共振成像的實(shí)驗(yàn)研究[J];中華心血管病雜志;2007年09期

3 馬占龍;滕皋軍;麥筱莉;居勝紅;鄧剛;孫軍輝;張洪英;余輝;李國昭;;血管內(nèi)皮祖細(xì)胞靶向損傷血管內(nèi)皮磁共振成像的實(shí)驗(yàn)研究[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2007年10期

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本文編號：2569495