【摘要】： H5N1亞型禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)不僅可以感染禽類(lèi),而且可以跨越種屬屏障感染人或其他哺乳動(dòng)物,嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。至今,H5N1禽流感病毒對(duì)人感染和致病的機(jī)制尚不完全清楚。 空斑形成特性是禽流感病毒的重要表觀特性之一,不同的H5N1病毒株空斑形成特性不同,同一人源H5N1病毒株在同種細(xì)胞上也可以形成大小和形態(tài)不同的空斑。來(lái)源于同一H5N1病毒株中的不同空斑類(lèi)型病毒基因序列差異小;如果它們之間存在致病性差異,比較容易確定病毒致病性差異的分子基礎(chǔ)。從H5N1禽流感病毒株空斑形成特性入手,從空斑形成特性具有不均一性的人源H5N1禽流感病毒株中挑斑純化,得到空斑形成性狀穩(wěn)定的大斑病毒亞克隆株和小斑病毒亞克隆株,對(duì)比研究大、小斑病毒在基因序列、致病力和復(fù)制能力上的差異,從而揭示大、小斑病毒對(duì)小鼠致病性的差異機(jī)制及與病毒致病性相關(guān)的基因位點(diǎn)。 一、不同來(lái)源H5N1禽流感病毒空斑形成特性的差異 本研究首先建立了H5N1禽流感病毒空斑測(cè)定方法,對(duì)比研究人源H5N1禽流感病毒株和禽源H5N1禽流感病毒株在MDCK細(xì)胞上的空斑形成特性,發(fā)現(xiàn)這兩種來(lái)源的H5N1病毒株形成的空斑存在顯著差異:野生水禽來(lái)源的H5N1禽流感病毒A/GbhGull/QH/02/06和A/Bhgoose/QH/01/06在MDCK細(xì)胞上只能形成針尖狀小斑,而且空斑形成時(shí)間較長(zhǎng);人源H5N1禽流感病毒A/Vietnam/1194/2004和A/Beijing/01/03在MDCK細(xì)胞上形成的空斑以大斑為主,夾雜小斑,大、小斑的直徑相差數(shù)倍,空斑形成時(shí)間較短。表明H5N1禽流感病毒空斑形態(tài)的差異與病毒宿主來(lái)源相關(guān),可能與病毒跨種屬傳播和進(jìn)化有關(guān)。 為進(jìn)一步對(duì)比研究人源H5N1禽流感病毒株A/Vietnam/1194/2004中大、小斑病毒在致病性、復(fù)制能力等方面的差異,采用空斑分離純化的方法,成功從人源H5N1禽流感病毒株A/Vietnam/1194/2004形成的混合斑中純化、挑選出大斑亞克隆病毒和小斑亞克隆病毒,純化的大、小斑病毒可穩(wěn)定傳代,空斑形成特性穩(wěn)定。為下一步研究大、小斑病毒對(duì)動(dòng)物致病性差異奠定了基礎(chǔ)。 二、人源H5N1禽流感病毒株中大、小斑病毒致病性差異及其機(jī)制 為明確人源H5N1禽流感病毒株A/Vietnam/1194/2004中大、小斑病毒在致病性上是否存在差異,分別測(cè)定這兩種空斑類(lèi)型病毒對(duì)雞和小鼠致病性。實(shí)驗(yàn)證明,大斑病毒和小斑病毒對(duì)雞的靜脈致病力指數(shù)IVPI分別2.98和2.99,證明兩者對(duì)雞都具有高致病性、彼此間致病力無(wú)明顯差異。選擇小鼠模型對(duì)比研究大、小斑病毒對(duì)哺乳動(dòng)物致病性的差異,根據(jù)大、小斑病毒感染小鼠體重變化、平均生活日、死亡率、LD50等指標(biāo)判斷,小斑病毒對(duì)小鼠的致病性顯著高于大斑病毒。 對(duì)大、小斑病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞上的復(fù)制能力測(cè)定顯示,大斑病毒的復(fù)制能力顯著高于小斑病毒。結(jié)合人源H5N1禽流感病毒和禽源H5N1禽流感病毒空斑形成特性差異、大、小斑病毒對(duì)小鼠致病性差異分析,表明病毒空斑形成的大小與病毒復(fù)制能力相關(guān),而病毒致病性差異可能與病毒復(fù)制能力差異無(wú)關(guān)。大斑病毒可能是禽流感病毒跨種屬?gòu)那蓊?lèi)感染人類(lèi)后從小斑病毒變異或進(jìn)化而來(lái)。這些結(jié)果對(duì)H5N1禽流感病毒感染人類(lèi)的致病機(jī)理和病毒進(jìn)化規(guī)律研究都具有重要意義。 研究顯示,小斑病毒對(duì)小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的親嗜性顯著高于大斑病毒:(1) A/Vietnam/ 1194/2004小斑病毒感染小鼠的腦中可以檢測(cè)到病毒,但大斑病毒感染小鼠腦中不能檢測(cè)到病毒;(2) A/Vietnam/1194/2004野生病毒株感染小鼠后,腦中分離到的病毒空斑測(cè)定顯示均一的小斑;(3) A/Vietnam/1194/2004感染小鼠腦中分離的病毒對(duì)小鼠的致病性與體外MDCK細(xì)胞中空斑純化的小斑病毒對(duì)小鼠致病性相同,都顯著高于大斑病毒。以上結(jié)果說(shuō)明,A/Vietnam/1194/2004小斑病毒對(duì)小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的具有很高的親嗜性,而大斑病毒不能侵入小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng),小斑病毒對(duì)小鼠的強(qiáng)致病性與其能侵入小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)。 進(jìn)一步研究顯示, A/Vietnam/1194/2004野生病毒株和小斑病毒滴鼻或靜脈感染小鼠后,在血液和腦組織中都可以檢測(cè)到病毒,兩者存在平行關(guān)系;而大斑病毒經(jīng)滴鼻或靜脈注射感染小鼠后,在血液中可以檢測(cè)到病毒,在腦中檢測(cè)不到病毒。經(jīng)血液感染小斑病毒和野生病毒株的小鼠比滴鼻感染的小鼠的死亡率高,平均存活天數(shù)短;而經(jīng)血液感染或滴鼻感染大斑病毒的小鼠都沒(méi)有死亡(肺內(nèi)可以檢測(cè)到病毒),說(shuō)明感染途徑對(duì)小斑病毒的致病性有顯著影響,經(jīng)血液感染比滴鼻感染對(duì)小鼠產(chǎn)生的病變更嚴(yán)重,但感染途徑對(duì)大斑病毒的致病性無(wú)影響。以上結(jié)果提示,小斑病毒能經(jīng)血液途徑突破血-腦屏障侵染小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)。 三、人源H5N1禽流感病毒株中大、小斑病毒空斑形成特性、致病性等差異的分子基礎(chǔ) 在確定大、小斑病毒在空斑形成特性、復(fù)制能力和致病性等表型上存在顯著差異后,進(jìn)一步對(duì)大、小斑病毒基因序列進(jìn)行測(cè)定和對(duì)比分析,以明確大、小斑病毒在基因序列上是否也存在差異。序列分析結(jié)果顯示,在大、小斑病毒的聚合酶蛋白(PB2、PB1及PA)、NP蛋白、膜蛋白HA和NA上存在21個(gè)氨基酸差異位點(diǎn)。根據(jù)這些蛋白的功能分析,大斑病毒的高復(fù)制能力可能與聚合酶蛋白上的多個(gè)差異位點(diǎn)有關(guān),而其對(duì)小鼠的低致病性可能是由于NA上第2位(N to D)和315位(C to R)的變異導(dǎo)致了對(duì)小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的親嗜性降低或喪失,從而對(duì)小鼠致病性減弱。 為進(jìn)一步確定不同氨基酸位點(diǎn)與病毒致病性、復(fù)制能力等的關(guān)系,我們構(gòu)建了A/Vietnam/1194/2004野生病毒株八基因片段與pHW2000的重組質(zhì)粒,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步構(gòu)建了大、小斑病毒的PB2、PB1、PA、HA、NA和NP與pHW2000的重組質(zhì)粒,為后續(xù)重組病毒拯救、病毒空斑形成特性、致病性差異的分子基礎(chǔ)研究奠定了基礎(chǔ)。 上述研究結(jié)果,對(duì)揭示禽流感病毒跨種傳播機(jī)制、遺傳進(jìn)化規(guī)律都具有重要意義。從H5N1禽流感病毒株空斑形成特性入手研究不同空斑類(lèi)型病毒在基因序列、致病力和復(fù)制能力上的差異,為研究禽流感病毒致病機(jī)制和進(jìn)化規(guī)律提供一種新的有效途徑。
【圖文】：

2.2 不同來(lái)源 H5N1 病毒株空斑形成特性測(cè)定結(jié)果分 別 對(duì) 野 生 水 禽 來(lái) 源 的 H5N1 禽 流 感 病 毒 株 A/GbhGull/QH/02/06 A/Bhgoose/QH/01/06 、 人 源 H5N1 禽 流 感 病 毒 株 A/Beijing/01/03 A/Vietnam/1194/2004 在 MDCK 細(xì)胞上的空斑形成特性進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，不來(lái)源的 H5N1 禽流感病毒株空斑形成特性明顯不同，人源 H5N1 禽流感病毒A/Beijing/01/03 形成大小不均一的空斑，大、小斑的大小差異超過(guò)兩倍，人源 H5禽流感病毒株 A/Vietnam/1194/2004 也形成大小不同的混合斑，其中的大斑A/Beijing/01/03 所形成的大斑的直徑還大。野生水禽來(lái)源的 H5N1 病毒A/GbhGull/QH/02/06 和 A/Bhgoose/QH/01/06 只形成均勻的針尖狀小斑，見(jiàn)圖 1.從空斑形成的時(shí)間上比較，，人源 H5N1 禽流感病毒株出斑時(shí)間較早，在感染后 染色就可以觀察到空斑形成，但禽源 H5N1 病毒株在感染后 48-72h 才能觀察到空形成。

圖 1.2 分離純化的大、小斑病毒 H5 特異性 PCR 鑒定M: Marker DL2000; P: 陽(yáng)性對(duì)照組; N: 陰性對(duì)照組;S1和 S2分別為小斑克隆株; L1 和 L2 為大斑克隆株;病毒的血凝活性測(cè)定對(duì) H5 檢測(cè)陽(yáng)性的大斑病毒（L1）和小斑病毒（S1）進(jìn)行血凝/1194/2004 作為陽(yáng)性病毒對(duì)照組，用生理鹽水作為陰性對(duì)照（紅細(xì)示，病毒對(duì)照組有血凝活性，生理鹽水對(duì)照組沒(méi)有，實(shí)驗(yàn)成立毒（標(biāo)記為 B1P2）和小斑病毒（標(biāo)記為 S1P2）都具有血凝活性見(jiàn)圖 1.3）。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R373

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 李永強(qiáng);H5N1禽流感病毒PB1 T677M 位點(diǎn)與PB2 I63T位點(diǎn)對(duì)病毒毒力的影響[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2011年

本文編號(hào)：2569484