【摘要】： 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)常引起持續(xù)性感染,導(dǎo)致慢性肝炎,并引起肝硬化和肝細(xì)胞癌。HBV感染引起慢性化的機(jī)制尚不清楚,但病毒編碼的蛋白對(duì)機(jī)體免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用是其中之一,隨著固有免疫應(yīng)答的深入研究,HBV對(duì)固有免疫的調(diào)節(jié)作用也日益受到重視,同時(shí)通過誘導(dǎo)固有免疫應(yīng)答有望在慢性HBV的治療中發(fā)揮一定的作用。 固有性免疫(innate immunity)應(yīng)答是機(jī)體快速抵抗微生物病原體的重要機(jī)制。表達(dá)于免疫細(xì)胞的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor,PRR)通過識(shí)別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP),啟動(dòng)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,誘導(dǎo)保護(hù)性細(xì)胞因子如Ⅰ型干擾素(IFN-α/β)和前炎癥細(xì)胞因子的表達(dá),發(fā)揮抗病毒固有免疫作用,并調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫(adaptive immunity)應(yīng)答。以Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)為代表的PRR是抗病毒固有免疫的關(guān)鍵性識(shí)別結(jié)構(gòu),TLR3,TLR7,TLR8和TLR9主要與病毒的識(shí)別有關(guān),如TLR3識(shí)別病毒雙鏈RNA(double stranded RNA,dsRNA)類似物聚肌苷-聚胞嘧啶核苷酸(polyinosinic-poly cytosine nucleotide,polyⅠ:C)。TLRs與特異性配體結(jié)合后,通過MyD88依賴性和TRIF依賴性途徑,激活NF-κB和干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferonregulatory factor3,IRF3),誘導(dǎo)抗病毒免疫分子的表達(dá)。此外,胞漿內(nèi)的PRR如視黃酸誘導(dǎo)基因Ⅰ(retinoic acid-inducible gene I,RIG-I)和黑素瘤分化相關(guān)基因5(melanoma differentiation-associated gene 5,MDA5)等也能識(shí)別病毒PAMP如dsRNA,誘導(dǎo)IFN-β的表達(dá)。在TLRs和RIG-I樣受體(RIG-I like receptors,RLRs)介導(dǎo)的固有免疫應(yīng)答信號(hào)通路中均能激活TANK結(jié)合激酶1(TANK-bindingkinase-1,TBK1),表明其在機(jī)體固有免疫應(yīng)答中起著至關(guān)重要的作用。通過激活TBK1,活化的TBK1能誘導(dǎo)IRF3二聚化并轉(zhuǎn)入核內(nèi),從而增強(qiáng)Ⅰ型干擾素的表達(dá),調(diào)節(jié)機(jī)體的固有免疫應(yīng)答,并影響適應(yīng)性免疫,有可能在慢性病毒感染如HBV和HCV感染的治療中發(fā)揮一定的作用。 目的: 本研究以肝癌細(xì)胞株HepG2和整合HBV的肝癌細(xì)胞株HepG2.2.15為細(xì)胞模型,研究dsRNA誘導(dǎo)肝細(xì)胞表達(dá)IFN-β的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)特點(diǎn);HBcAg真核表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染及其重組蛋白處理HepG2細(xì)胞,觀察HBcAg對(duì)dsRNA誘導(dǎo)肝細(xì)胞表達(dá)IFN-β的調(diào)節(jié)作用;TBK1真核表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞和HepG2.2.15細(xì)胞,觀察TBK1的抗HBV作用。本研究以期為闡明肝細(xì)胞內(nèi)抗病毒免疫機(jī)制和HBV慢性感染的分子機(jī)制,同時(shí)也為研制新型慢性乙肝治療藥物提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。 方法: 1.HBcAg對(duì)dsRNA誘導(dǎo)肝細(xì)胞表達(dá)IFN-β的調(diào)節(jié)作用: 1.1 pcDNA3-HBc質(zhì)粒的構(gòu)建:以HBV ayw亞型全長質(zhì)粒pCP10為模板,PCR擴(kuò)增編碼HBcAg的基因,將其插入真核表達(dá)質(zhì)粒載體pcDNA3。 1.2 polyⅠ:C刺激HepG2細(xì)胞誘導(dǎo)IFN-β的表達(dá):取對(duì)數(shù)生長期HepG2細(xì)胞,polyⅠ:C以0μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml刺激細(xì)胞12h、24h,刺激后提取細(xì)胞總RNA,熒光定量PCR檢測IFN-βmRNA表達(dá)。 1.3 pcDNA3-HBc轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞對(duì)polyⅠ:C誘導(dǎo)表達(dá)IFN-β的作用:取對(duì)數(shù)生長期HepG2細(xì)胞,將質(zhì)粒pcDNA3-HBc以1.2μg轉(zhuǎn)染細(xì)胞,培養(yǎng)24h后,100μg/ml polyⅠ:C刺激細(xì)胞24h,定量PCR檢測IFN-βmRNA表達(dá);ELISA檢測細(xì)胞上清中IFN-β濃度。 1.4 HBcAg重組蛋白對(duì)polyⅠ:C誘導(dǎo)肝細(xì)胞表達(dá)IFN-β的調(diào)節(jié)作用:取對(duì)數(shù)生長期HepG2細(xì)胞,HBcAg重組蛋白以0μg/ml、10μg/ml處理細(xì)胞48h后,100μg/ml polyⅠ:C刺激細(xì)胞24h。定量PCR檢測IFN-βmRNA表達(dá);ELISA檢測細(xì)胞上清中IFN-β濃度。 2 TBK1對(duì)dsRNA誘導(dǎo)肝細(xì)胞表達(dá)IFN-β的調(diào)節(jié)作用: 2.1 pcDNA3-hTBK1質(zhì)粒的構(gòu)建:以hTBK1 DNA為模板,PCR擴(kuò)增目的基因,將其插入真核表達(dá)質(zhì)粒載體pcDNA3。 2.2 pcDNA3-hTBK1轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞對(duì)polyⅠ:C誘導(dǎo)表達(dá)IFN-β的作用:取對(duì)數(shù)生長期Hela細(xì)胞,將質(zhì)粒pcDNA3-hTBK1以0μg、0.6μg、1.2μg、1.8μg轉(zhuǎn)染細(xì)胞,培養(yǎng)24h后,100μg/ml polyⅠ:C刺激細(xì)胞24h,定量PCR檢測IFN-βmRNA表達(dá);ELISA檢測細(xì)胞上清中IFN-β濃度。 2.3 pcDNA3-hTBK1轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞對(duì)polyⅠ:C誘導(dǎo)表達(dá)IFN-β的作用:取對(duì)數(shù)生長期HepG2細(xì)胞,將質(zhì)粒pcDNA3-hTBK1以不同濃度轉(zhuǎn)染細(xì)胞,培養(yǎng)24h后,100μg/ml polyⅠ:C刺激細(xì)胞24h,定量PCR檢測IFN-βmRNA表達(dá);ELISA檢測細(xì)胞上清中IFN-β濃度。 2.4 polyⅠ:C刺激HepG2.2.15細(xì)胞誘導(dǎo)IFN-β的表達(dá):取對(duì)數(shù)生長期HepG2.2.15細(xì)胞,polyⅠ:C以0μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml刺激細(xì)胞24h,定量PCR檢測IFN-β的表達(dá);ELISA檢測細(xì)胞上清中IFN-β濃度;時(shí)間分辨熒光免疫測定技術(shù)(TRFIA)檢測細(xì)胞上清中HBsAg和HBeAg含量;定量PCR檢測細(xì)胞上清和細(xì)胞中HBV DNA拷貝數(shù)。 2.5 pcDNA3-hTBK1轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞對(duì)polyⅠ:C誘導(dǎo)抗病毒作用的調(diào)節(jié)作用:取對(duì)數(shù)生長期HepG2.2.15細(xì)胞,將質(zhì)粒pcDNA3-hTBK1以1.8μg轉(zhuǎn)染細(xì)胞,培養(yǎng)24h后,polyⅠ:C以0μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml刺激細(xì)胞24h,定量PCR檢測IFN-βmRNA表達(dá);ELISA檢測細(xì)胞上清中IFN-β濃度;同時(shí)檢測細(xì)胞上清中HBsAg和HBeAg含量及上清和細(xì)胞中HBV DNA拷貝數(shù)。 結(jié)果: 1.HBcAg對(duì)dsRNA誘導(dǎo)肝細(xì)胞表達(dá)IFN-β的調(diào)節(jié)作用: 1.1經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ酶切電泳鑒定,以及重組體插入片段的DNA序列測定,證實(shí)成功地構(gòu)建了含C基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-HBc。 1.2 polyⅠ:C刺激HepG2細(xì)胞誘導(dǎo)IFN-β表達(dá):polyⅠ:C刺激細(xì)胞12h,與對(duì)照組相比,刺激組IFN-β表達(dá)顯著增高(P＜0.05),并隨濃度增高而表達(dá)升高,各刺激組有顯著差異(P＜0.05),同時(shí)polyⅠ:C刺激細(xì)胞24h較刺激12h組IFN-β表達(dá)顯著增高(P＜0.05)。 1.3 pcDNA3-HBc轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞對(duì)polyⅠ:C誘導(dǎo)表達(dá)IFN-β的作用:與對(duì)照組相比,1.2μg轉(zhuǎn)染組IFN-β表達(dá)有所降低,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);與對(duì)照組相比,細(xì)胞上清中IFN-β濃度顯著減少(P＜0.05)。 1.4 HBcAg重組蛋白對(duì)polyⅠ:C誘導(dǎo)肝細(xì)胞表達(dá)IFN-β的調(diào)節(jié)作用:與對(duì)照組相比,HBcAg重組蛋白處理組IFN-β表達(dá)和濃度均顯著降低(P＜0.05)。 2.TBK1對(duì)dsRNA誘導(dǎo)肝細(xì)胞表達(dá)IFN-β的調(diào)節(jié)作用: 2.1經(jīng)XbaⅠ和BamHⅠ酶切電泳鑒定,以及重組體插入片段的DNA序列測定,證實(shí)成功地構(gòu)建了含hTBK1的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-hTBK1。 2.2 pcDNA3-hTBK1轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞對(duì)polyⅠ:C誘導(dǎo)表達(dá)IFN-β的作用:與對(duì)照組和其他轉(zhuǎn)染組相比,1.8μg轉(zhuǎn)染組IFN-β表達(dá)顯著增加;與對(duì)照組和0.6μg轉(zhuǎn)染組相比,1.2μg轉(zhuǎn)染組IFN-β表達(dá)也顯著增加(P＜0.05);與對(duì)照組相比,各轉(zhuǎn)染組IFN-β濃度均有增加,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。 2.3 pcDNA3-hTBK1轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞對(duì)polyⅠ:C誘導(dǎo)表達(dá)IFN-β的作用:隨著轉(zhuǎn)染量的增加,IFN-β表達(dá)顯著增加,與對(duì)照組和0.6μg轉(zhuǎn)染組相比,1.2μg、1.8μg轉(zhuǎn)染組IFN-β表達(dá)顯著增加,不同濃度轉(zhuǎn)染組有顯著差異(P＜0.05);與對(duì)照組相比,各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞上清IFN-β濃度均無顯著差異(P＞0.05)。 2.4 polyⅠ:C刺激HepG2.2.15細(xì)胞誘導(dǎo)IFN-β的表達(dá):與對(duì)照組相比,不同濃度刺激組IFN-β表達(dá)無顯著差異(P＞0.05)。隨著polyⅠ:C刺激濃度的增加,上清中IFN-β濃度呈梯度顯著增加,不同濃度刺激組也存在顯著差異(P＜0.05)。與對(duì)照組相比,不同濃度刺激組上清中HBsAg和HBeAg含量、及上清和細(xì)胞中HBV DNA拷貝數(shù)均無顯著差異(P＞0.05)。 2.5 pcDNA3-hTBK1轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞對(duì)polyⅠ:C誘導(dǎo)抗病毒作用的調(diào)節(jié)作用:與對(duì)照組和25μg/ml刺激組相比,100μg/ml polyⅠ:C刺激組IFN-β表達(dá)顯著增加(P＜0.05);與對(duì)照組相比,各刺激組上清中IFN-β濃度均無顯著差異(P＞0.05)。與對(duì)照組相比,50μg/ml和100μg/ml polyⅠ:C刺激組HBsAg表達(dá)顯著降低(P＜0.05),不同濃度刺激組HBeAg表達(dá)無顯著差異(P＞0.05);與對(duì)照組相比,不同濃度刺激組上清HBV DNA拷貝數(shù)均有顯著下降(P＜0.05),各組則無顯著差異(P＞0.05);不同濃度刺激組細(xì)胞HBV DNA拷貝數(shù)無顯著差異(P＞0.05)。 結(jié)論: polyⅠ:C刺激HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞可誘導(dǎo)IFN-β表達(dá),提示肝細(xì)胞可能在抗病毒固有性免疫應(yīng)答中起重要的作用。HBcAg真核表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染及其重組蛋白處理可抑制polyⅠ:C誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞表達(dá)IFN-β,提示HBcAg具有拮抗機(jī)體抗病毒固有免疫的作用。hTBK1真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞和HepG2.2.15細(xì)胞,可促進(jìn)polyⅠ:C誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞和HepG2.2.15細(xì)胞表達(dá)IFN-β,同時(shí)一定濃度的hTBK1轉(zhuǎn)染可有效降低HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg及HBV DNA拷貝數(shù),提示TBK1可能通過增強(qiáng)固有免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,增加細(xì)胞因子如Ⅰ型干擾素(IFN-β)的表達(dá),進(jìn)而對(duì)HBV起到一定抑制作用。結(jié)果提示,病毒感染時(shí)肝細(xì)胞可產(chǎn)生一定的固有免疫應(yīng)答,發(fā)揮抗病毒作用,而HBV可通過表達(dá)病毒蛋白HBcAg拮抗機(jī)體的抗病毒固有免疫應(yīng)答,同時(shí)促進(jìn)TBK1的表達(dá)和激活能提高肝細(xì)胞的固有免疫應(yīng)答。研究結(jié)果有助于了解肝細(xì)胞在抗HBV感染固有免疫應(yīng)答中的作用以及HBV慢性感染的分子機(jī)制,同時(shí)也為研制新的慢性乙肝治療藥物提供新的思路和策略。
【圖文】：

圖1.1HBcAgPcR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1.1ElectroPhoretieanalysisofHBcAgPCRProduetLanel，2:HBcAgPCRProduet圖1.2peDNA3一HBc酶切產(chǎn)物Fig.1.2EleetroPhoretieanrestrietionenz犯nediPeDNA3一HBe

實(shí)驗(yàn)結(jié)果1HBcAg對(duì)dsRNA誘導(dǎo)肝細(xì)胞表達(dá)IFN一p的調(diào)節(jié)作用1.1penNA3一HBc質(zhì)粒的構(gòu)建以HBvayw亞型全長質(zhì)粒pcP10為模板，PcR擴(kuò)增編碼HBcAg的基脂糖凝膠電泳可見約55lbp的目的基因片段，見圖1.1。采用EcoRI和Bam步酶切篩選重組peDNA3一HBc質(zhì)粒陽性克隆，瓊脂糖凝膠電泳可見一條約目的片段和約5.4kb的載體片段，與預(yù)期結(jié)果相符。篩選的陽性克隆經(jīng)上DNA序列測定，結(jié)果與HBVayw亞型核心抗原基因DNA序列完全一致，組pcDNA3一HBc質(zhì)粒構(gòu)建成功，見圖1.2和圖1.3。bPl2b
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R392

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