【摘要】： 論文一犬穿通性顱腦火器傷模型的建立及其生理、病理改變的觀察 目的 對(duì)現(xiàn)有犬穿通性顱腦火器傷模型進(jìn)行改進(jìn),延長(zhǎng)動(dòng)物的存活時(shí)間,觀察其生理、病理改變,為顱腦火器傷的病理、生理和分子生物學(xué)研究提供更加完善的平臺(tái)。 方法 本地成年雄性雜種犬19只,體重20～25kg,隨機(jī)分為三組:A組按照傳統(tǒng)模型,直接致傷,n=5;B組為改進(jìn)的模型,左側(cè)額顳頂部骨瓣開顱,骨窗大小約6.0×8.0cm,暴露腦組織后致傷,n=9:C組為對(duì)照組,n=5,僅予開顱手術(shù)。致傷槍支為東風(fēng)-SS03型小口徑速射手槍,初速190～210米/秒,彈丸質(zhì)量2.60±0.05g。實(shí)驗(yàn)前30min給予嗎啡10mg、阿托品0.5mg肌肉注射,實(shí)驗(yàn)開始時(shí)給予硫賁妥鈉25mg/kg腹腔注射,氣管插管,以中間帶孔的木制牙墊固定于張口位,槍擊前靜脈給予氯胺酮40～50mg。犬仰臥,頭偏向右側(cè)、固定,頭下墊沙袋及厚木板,手槍固定于金屬支架上,距離犬頭20cm,激光指示器校準(zhǔn);入射點(diǎn):A組為左側(cè)額骨顴突后2.5～3.0cm,B組為左側(cè)額葉冠狀回中部,入射角度90°;射擊后受傷腦組織不做電凝止血,僅以明膠海綿、棉片保護(hù)創(chuàng)傷區(qū)�；萜�78354C型生理監(jiān)測(cè)儀連續(xù)記錄心率、血壓、呼吸變化,致傷后30min動(dòng)脈采血做血?dú)夥治?靜脈采血檢驗(yàn)血糖及肝、腎功能。B組傷后6h,從四個(gè)區(qū)域取皮層腦組織,分別距傷道＜0.5cm、0.5～2.0cm、2.0～4.0 cm、＞4.0cm,C組同一時(shí)間按照對(duì)應(yīng)部位取標(biāo)本。一部分以甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色,光鏡下觀察;另一部分以戊二醛保存,鋨酸固定,Epon812包埋,超薄切片,電鏡觀察。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用t檢驗(yàn)及方差分析。 結(jié)果 B組傷后呼吸暫停時(shí)間和存活時(shí)間均大于A組(P＜0.01);A組MAP于傷后10min降至最低點(diǎn),繼之以小幅度的升高,后期逐漸降低至正常值水平以下;B組傷后出現(xiàn)快速而短暫的明顯的血壓升高,繼而于傷后10min大幅度降低至波谷,后期逐漸回升至接近正常值水平;傷后兩組心率均立即下降,傷后10min回升達(dá)峰值,之后再次緩慢下降,B組的變化幅度大于A組。傷后30min,A、B兩組致傷犬除血糖高于C組(p＜0.05)之外,其他指標(biāo)差異不顯著。光鏡下,腦組織可出現(xiàn)空泡化、網(wǎng)格化,神經(jīng)元胞體、胞核固縮、變形,胞質(zhì)深染,可見核偏移;星形膠質(zhì)細(xì)胞增大明顯,小膠質(zhì)細(xì)胞增多;腦組織間散在小片狀出血,蛛網(wǎng)膜下腔出血,血管周圍間隙明顯增寬,部分血管破裂出血。電鏡下,神經(jīng)元胞核內(nèi)異染色質(zhì)凝聚、邊集,核膜模糊,胞質(zhì)部分溶解,胞膜破損,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、脫顆粒,線粒體嵴破壞、消失、甚至空泡化,核糖體減少,溶酶體增多;膠質(zhì)細(xì)胞足突腫脹,胞膜破損,線粒體腫脹,嵴消失,呈空泡狀;有髓神經(jīng)纖維脫髓鞘多見,可見局部缺損、斷裂,軸索區(qū)形成空腔;血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞胞膜模糊、局部破損,胞核內(nèi)異染色質(zhì)邊集,線粒體嵴缺失、空泡化,胞質(zhì)內(nèi)有較多的胞飲小泡,基膜大部分模糊,局部溶解。距離原發(fā)傷道越近,組織損害程度越重。 結(jié)論 經(jīng)過改進(jìn)的犬穿通性顱腦火器傷模型與現(xiàn)有的模型相比,動(dòng)物傷后存活時(shí)間明顯延長(zhǎng),彈著點(diǎn)更準(zhǔn)確,傷道一致性更好,有利于進(jìn)行更為深入的病理、生理和分子生物學(xué)研究。 論文二犬穿通性顱腦火器傷腦組織繼發(fā)損害機(jī)制的研究 目的 探討TNF-α和NF-κB/Rel家族成員在犬穿通性顱腦火器傷腦組織繼發(fā)損害機(jī)制中的作用,并比較它們?cè)谀X組織不同區(qū)域的表達(dá)差異,為更精確地劃分受損傷腦組織的病理分區(qū)提供依據(jù)。 方法 本地成年雄性雜種犬14只,體重20～25kg,隨機(jī)分為兩組:B組(n=9)為改進(jìn)的模型,暴露腦組織后致傷;C組為對(duì)照組(n=5),僅予開顱手術(shù)。B組于致傷后6h分別從三個(gè)區(qū)域取皮層腦組織,分別距傷道0.5～2.0cm、2.0～4.0 cm、＞4.0cm,標(biāo)志為B1組、B2組、B3組;C組于開顱手術(shù)后6h從皮層對(duì)應(yīng)部位取材;一部分標(biāo)本以10%甲醛溶液固定,24h后常規(guī)石蠟包埋、切片,采用免疫組化SABC法檢測(cè),一抗為兔抗大鼠TNF-α、兔抗山羊COX-2、Caspase-3,每張切片選取5個(gè)高倍視野,每高倍視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比。另一部分標(biāo)本液氮保存,分別行western blot及RT-PCR檢測(cè)。western blot采用兔抗大鼠TNF-α、兔抗山羊COX-2、兔抗山羊Caspase-3一抗,以β-actin為內(nèi)參照,Bandleader軟件分析各電泳條帶與β-actin蛋白含量的比值,計(jì)算相對(duì)量。RT-PCR以gapdh為內(nèi)參照,TNF-α(413bp)上游引物:5'CCC CAA GTG ACA AGC CAG TA 3',下游引物:5'CAA AGT CCA GAT TAG GCA GAT 3';NF-κB(P65)(490bp)上游引物:5'TAA TCG CCA TAG CCA TAG TCG 3',下游引物:5'GTT TTG CCT CCC AGT TCTGA 3';NF-κB(P52)(381bp)上游引物:5'CCT ATC CAC GAC AAC CTT GC 3',下游引物:5'CAT AGA TGC TGC TGA CCC AAC 3';COX-2(238bp)上游引物:5'ATCCCC TTC CTG CGA AAT AC 3',下游引物:5'GCA GAA GAA ACT TTT CCA CAA TC 3':Caspase-3(416bp)上游引物:5'ACC CGA AGG CTT GCA TAA GG 3',下游引物:5'ACC GAG GTG CCA TTC CAG TA 3';gapdh(419bp);上游引物:5'TCC CGC CAACAT CAAA 3',下游引物:5'TGACCTTGC CCA CAG C 3'。PCR反應(yīng)產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠圖像分析系統(tǒng)下觀察并攝像,用Bandleader軟件進(jìn)行掃描分析,以目的基因條帶與gapdh條帶吸光度容積的比值作為目的基因mRNA的相對(duì)含量。以上數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS10.0軟件,多組之間比較采用方差分析。 結(jié)果 TNF-α和COX-2的陽(yáng)性染色部位為胞漿,致傷后在不同區(qū)域的腦組織的表達(dá)率由B3至B2、B1逐步升高,差異顯著,它們與正常腦組織之間也存在顯著差異;Caspase-3在胞核、胞漿均有陽(yáng)性染色,B2、B3以及C組之間的陽(yáng)性表達(dá)率具有顯著差異。Western blot顯示:TNF-α、COX-2、Caspase-3蛋白在不同區(qū)域的腦組織的表達(dá)相對(duì)量均高于正常腦組織,其差異具有顯著性(p＜0.05);其中B1與B2組COX-2蛋白的表達(dá)相對(duì)量具有顯著差異(p＜0.01)。RT-PCR顯示:TNF-α、P65、P52、COX-2、Caspase-3的mRNA在不同區(qū)域的腦組織的表達(dá)相對(duì)量與正常腦組織之間均有顯著差異(p＜0.01);其中P65、COX-2的表達(dá)相對(duì)量由B3至B2、B1組逐步增高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論 (1)TNF-α參與了犬腦火器傷后的繼發(fā)性損害,但與損害的程度之間并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系;(2)RNA水平的檢測(cè)提示RelA(p65)和NF-κB(p52)都參與了犬腦火器傷后的繼發(fā)性損害,但在因外源性刺激而激活的NF-κB蛋白中RelA(p65)可能比NF-κB(p52)具有更大的比重,主要是由RelA(p65)介導(dǎo)了顱腦火器傷的繼發(fā)性腦損害。(3)通過免疫組化、western blot和RT-PCR的方法,觀察到COX-2和Caspase-3的水平在火器傷犬腦組織中的表達(dá)均顯著高于單純手術(shù)犬,提示它們都參與了犬腦火器傷后的繼發(fā)性損害,神經(jīng)細(xì)胞的變性和調(diào)亡是同時(shí)存在的。在不同創(chuàng)傷分區(qū)之間表達(dá)的差異顯示,因火器傷所致的神經(jīng)細(xì)胞減少,可能更多地歸因于COX-2介導(dǎo)的神經(jīng)元變性;而Caspase-3在不同創(chuàng)傷分區(qū)之間的表達(dá)差異并不肯定,提示至少在腦火器傷的早期,神經(jīng)細(xì)胞的調(diào)亡并不是主要事件。 論文三實(shí)驗(yàn)性犬顱腦火器傷的皮層腦電監(jiān)測(cè) 目的 通過對(duì)動(dòng)物模型犬的顱腦火器傷后皮層腦電監(jiān)測(cè)(ECoG),初步探討顱腦火器傷與腦電特征的相關(guān)性。 方法 本地成年雄性雜種犬9只,體重20～25kg,左側(cè)額顳頂部骨瓣開顱,骨窗大小約6.0×8.0cm,暴露腦組織;應(yīng)用Oxford Medelec數(shù)字腦電圖系統(tǒng)行ECoG監(jiān)測(cè),采用銀針電極固定于額極、中央?yún)^(qū)、頂、枕區(qū),另設(shè)頭皮參考電極2個(gè),以參考導(dǎo)聯(lián)方式記錄,靈敏度50uV/5mm,高頻濾波30Hz,時(shí)間常數(shù)0.3S,走紙速度30mm/s,行ECoG監(jiān)測(cè)＞30min后,以東風(fēng)-SS03型小口徑速射手槍射擊冠狀回中部致傷并觀察生理、生化指標(biāo),傷后30min再行ECoG監(jiān)測(cè),持續(xù)監(jiān)測(cè)時(shí)間＞30min,分析損傷早期不同區(qū)域的ECoG變化情況。 結(jié)果 通過連續(xù)觀察實(shí)驗(yàn)犬火器傷后的ECoG,損傷早期基本節(jié)律普遍抑制,以腦組織直接破壞區(qū)最顯著,波幅低平提示嚴(yán)重?fù)p害;腦破壞區(qū)周圍的波幅波率有所增加,間斷給氧可見波幅和頻率變化,此反應(yīng)性有良好預(yù)后趨向。 結(jié)論 ECoG監(jiān)測(cè)在顱腦火器傷后的動(dòng)態(tài)觀察有利于早期診斷,對(duì)損傷程度的評(píng)估和判定預(yù)后也有一定價(jià)值。
【圖文】：

30min，A、B兩組致傷犬除血糖高于C組(P(0.05)之外，其他指標(biāo)差見表3和圖3。表3，犬顱腦火器傷模型傷后血液生化及血?dú)庵笜?biāo)變化A組B組C組Glu(~。叫ALT(u/L) 3.97士0.40* 4.10士0.60* 3.05士0.43 41.91士6.2946.82士5.2940.01士6.7448.72士7.1654.73士10.4350.52士6.18BUN(umo譏) 4.00士 0.673.91士 0.614.05士046100.16士10.24106.64士12.74101.74士11.22Pa02(mmHg)79.28士9.12 91.57士14.5392.13士7.43PaC02(nunHg)37.37士5.0232.80士46937.82士6.881230士3.6918.07士4.1417.56士4.04*與C組比較P<o.os傷傷傷傷傷傷 傷后血液生化及血?dú)夥治龈淖?變11120廠一一一一一一一一一一一一一~—一一門 組11100卜幽.11二二 }組8880卜..1曰.1}!二幾瓦習(xí) 組6660卜二..11..!}}.B全日 }}}4440卜..石 ..1..1..1‘干}}止已二查竺三 三2220卜 ..1..1..!..!..1日..局 !!! OOO‘月...「二~.J一....【~工日‘....L--L‘J....匕〕習(xí)目J....‘司‘二J....~J-山J...L.J.二.月 ...一上JJJ GGGluALTASTBUNCrPa02PaCOZHCO3一 一圖3

TNF一a表達(dá):a為C組表達(dá)(X400)，b為Bl組表達(dá)(x400)，，C為BZ組表達(dá)(X400)，d為B3組表達(dá)(x400)，
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R651.15;R-332

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2566732