發(fā)布時間：2019-11-27 05:24

【摘要】： 目的: 利用基因工程方法和噬菌體抗體庫技術(shù)構(gòu)建人源性白念珠菌單鏈抗體文庫,并從中篩選出特異性的噬菌體單鏈抗體,為白念珠菌感染的免疫診斷及免疫治療提供新的方法和手段。 方法: 1 ScFv的連接:取白念珠菌恢復(fù)期病人外周血淋巴細(xì)胞(PBMC)作為B細(xì)胞的來源,提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,通過降落PCR的方法分別擴(kuò)增抗體重鏈可變區(qū)(V_H)和抗體輕鏈可變區(qū)(V_L)基因片段。以V_H和V_L基因為模板分別擴(kuò)增V_H-linker和V_L-linker,然后利用SOE-PCR將他們拼接成完整的單鏈抗體(ScFv)基因。最后,在單鏈抗體基因片段的兩端引入酶切位點SfiⅠ和NotⅠ。 2 ScFv與噬菌粒載體pCANTAB-5E的拼接及抗體庫的構(gòu)建:單鏈抗體基因片段與噬菌粒載體pCANTAB-5E各自經(jīng)SfiⅠ和NotⅠ酶切,連接成重組噬菌體,并轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌XL1-Blue中表達(dá),經(jīng)輔助噬菌體(helper phage)VCSM13擴(kuò)增后,構(gòu)建出初級的噬菌體抗體庫。 3噬菌體抗體庫的富集篩選:利用白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株與臨床分離株對抗體庫進(jìn)行負(fù)正篩選,共進(jìn)行5輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”的篩選,使抗體庫得到有效富集。 4噬菌體ScFv的ELISA鑒定:對第五輪篩選后的陽性克隆的親和性分別用白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株、臨床分離株和大腸桿菌進(jìn)行ELISA鑒定。 結(jié)果: 1從人淋巴細(xì)胞中提取的總RNA在1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果中可見明顯的28s、18s和5s條帶;V_H基因片段的大小約為340bp,V_L基因片段的大小約為300bp;組裝以后的ScFv基因片段約為700bp。 2單鏈抗體基因片段和pCANTAB-5E分別經(jīng)SfiⅠ和NotⅠ雙酶切后,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌XL1-Blue,結(jié)果獲得4.5×10~7cfu/μg氨芐青霉素抗性克隆。隨機(jī)酶切反應(yīng)鑒定陽性插入率為83.3%(20/24)。質(zhì)粒PCR與測序結(jié)果證實抗體重鏈和輕鏈以整碼的單鏈抗體方式準(zhǔn)確的插入載體。 3經(jīng)過5輪白念珠菌“吸附-洗脫-擴(kuò)增”的負(fù)正性篩選,得到一個4.5×10~7的噬菌體抗體庫,說明特異性的ScFv得到了有效富集。 4對第五輪篩選后得到的噬菌體抗體進(jìn)行ELISA檢測,結(jié)果顯示:3/9的克隆呈陽性反應(yīng)。 結(jié)論: 利用噬菌體抗體庫技術(shù),構(gòu)建了庫容量為4.5×10~7的白念珠菌相關(guān)人源單鏈抗體庫,并利用白念珠菌臨床分離株進(jìn)行初步篩選。通過ELISA鑒定,獲得的噬菌體抗體克隆具有特異性,為白念珠菌感染的臨床檢測、藥物治療及耐藥性的研究提供了理論依據(jù)。
【圖文】：

抗體庫的多樣性表達(dá)Fig3ExPressthediversityofantibo勿library

抗體篩選示意圖
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2566473