【摘要】：目的：檢測弓形蟲感染誘導(dǎo)宿主細(xì)胞自噬的程度，研究細(xì)胞自噬在弓形蟲增殖復(fù)制中的作用。 方法：對使用自噬抑制劑、誘導(dǎo)劑作用后不同時間點的弓形蟲感染復(fù)制動力學(xué)檢測以及形態(tài)檢測，判斷自噬在弓形蟲增殖復(fù)制過程中的作用。昆明小鼠（雌鼠，5-7周齡，體重16-20g）用于RH株（弓形蟲強(qiáng)毒株）的保種和實驗。將RH株腹腔注射感染小鼠平均4-5天發(fā)病無菌抽取腹水純化弓形蟲計數(shù)后感染HEF細(xì)胞用于實驗。實驗分組如下：①正常對照組（HEF細(xì)胞）②RH株+HEF細(xì)胞③自噬抑制劑+RH株+HEF細(xì)胞④自噬誘導(dǎo)劑+RH株+HEF細(xì)胞。分別用自噬抑制劑Bafilomycin A1及自噬誘導(dǎo)劑氯化鋰作用于HEF細(xì)胞，，然后將弓形蟲（RH株）速殖子懸液分別以蟲/細(xì)胞2:1、4:1、8:1、16:1感染HEF細(xì)胞,作用1h、2h、4h、8h、24h、48h、96h。將計數(shù)后的HEF細(xì)胞于六孔板中培養(yǎng)待細(xì)胞爬片貼壁后分別進(jìn)行Giemsa染色和吖啶橙熒光染色，于24孔板中進(jìn)行MDC（Monodansylcadaverin）熒光染色。采用吖啶橙熒光染色和MDC熒光染色檢測HEF細(xì)胞自噬情況，采用Giemsa染色檢測不同時間點的弓形蟲感染復(fù)制動力學(xué)。通過建立弓形蟲感染的小鼠模型，分別使用自噬抑制劑巴弗洛霉A1（bafilomycinA1）和自噬誘導(dǎo)劑氯化鋰對弓形蟲感染小鼠模型進(jìn)行了干預(yù)，應(yīng)用熒光定量PCR檢測不同實驗條件下弓形蟲的增殖情況。 結(jié)果：弓形蟲增殖觀察：Giemsa染色觀察弓形蟲速殖子在細(xì)胞內(nèi)的寄生：隨機(jī)鏡檢100個細(xì)胞，檢測不同時間蟲體的侵襲率和胞內(nèi)平均增殖數(shù)，侵襲率=侵襲的細(xì)胞數(shù)/100×100%、胞內(nèi)平均增殖數(shù)=各細(xì)胞內(nèi)蟲體數(shù)量總和/被侵襲的細(xì)胞數(shù)×100%。吖啶橙和MDC熒光染色用以觀察判斷細(xì)胞自噬過程的發(fā)生情況。吖啶橙和MDC熒光染色結(jié)果表明自噬抑制劑BafilomycinA1及自噬誘導(dǎo)劑氯化鋰可分別抑制和促進(jìn)HEF細(xì)胞自噬，Giemsa染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用自噬誘導(dǎo)劑氯化鋰可以促進(jìn)弓形蟲在HEF細(xì)胞內(nèi)的增殖，使用自噬抑制劑Bafilomycin A1可以抑制弓形蟲在HEF細(xì)胞內(nèi)的增殖。熒光定量PCR檢測實驗結(jié)果表明，巴弗洛霉素A1劑量與小鼠體內(nèi)弓形蟲數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，而誘導(dǎo)劑氯化鋰與小鼠體內(nèi)弓形蟲數(shù)量呈正相關(guān)。 結(jié)論：弓形蟲感染后可促進(jìn)HEF細(xì)胞自噬，促進(jìn)HEF細(xì)胞自噬可以促進(jìn)弓形蟲在宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖，調(diào)控宿主細(xì)胞自噬可調(diào)控弓形蟲增殖復(fù)制。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R382.5

【參考文獻(xiàn)】

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